[发明专利]一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其特征在于，所述的抗原是猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。

2.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的猪流行性腹泻病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml。

3.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的猪流行性腹泻病毒是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。

4.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。

5.如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

6.权利要求1所述的二联疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备Vero细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成单层后接种猪流行性腹泻病毒；

（2）取猪流行性腹泻病毒SD10株按1%接种量接种到Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

（3）接毒后，当细胞病变达75%以上时收获病毒液，反复冻融3次；

（4）取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

（5）将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为0.2%，37℃灭活18小时；

（6）按发酵罐容积70%（V/V）加入Minca液体培养基，同时按培养基0.1%（V/V）加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3%（V/V）向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35%，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液；

（7）各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中；采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取；

（8）按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；

（9）将（5）中的病毒溶液和（8）中的混合纤毛液例混合后，与疫苗佐剂混合制备成疫苗。