[发明专利]一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用。

背景技术

表皮生长因子受体（EGFR）家族是一类跨膜蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，通过调节下游信号转导，在肿瘤细胞的发生、发展和转移中发挥重要作用。胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭及新生血管形成等方面起关键作用（Mendelsohn J,J Clin Oncol,2003,21(14):2787-2799），EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。

EGFR在肿瘤中高表达以及其在肿瘤生长分化中起的重要作用，使其成为肿瘤诊断、抗肿瘤治疗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白与应用，达到对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，且毒副作用小。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，轻链可变区的末端连接有精氨酸九聚体；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一种编码基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

一种基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白的制备方法，包括以下操作：

1）将如SEQ.ID.NO.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T-1表达载体，构建重组质粒；

2）将所构建的重组质粒转染大肠杆菌，并在含氨苄青霉素的YTA培养基中培养，培养至OD600为0.4～0.6时，添加IPTG诱导表达，收集诱导后的菌液离心，收集细菌后破菌、离心，收集上清；

3）使用GST亲和层析柱纯化分离上清中的融合蛋白，得到基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白。

一种抗EGFR单链抗体，包括通过连接肽相连接的重链可变区和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

一种编码抗EGFR单链抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

所述的融合蛋白在制备靶向EGFR的药用载体、携带载体中的应用。

所述的应用，包括所述的融合蛋白在携带siRNA、microRNA、脂质体中的一种或几种进入肿瘤细胞内部并释放的应用。

所述的核苷酸在构建表达载体，以及制备抗肿瘤药物、抗肿瘤辅助药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，采用经过筛选的连接肽连接单链的EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区，既保留了抗体与EGFR结合的特异性和亲和力，保证了所构建的融合蛋白对EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其构建、表达和纯化，实现了其低成本的获取，另一方面保证了其对EGFR结合、尤其是内化入细胞对分子大小、抗体活性的要求，确保了其对EGFR结合、靶向肿瘤细胞内化的可行性和准确性。

进一步的，精氨酸九聚体是一种连续的由9个精氨酸构成的短肽，作为内化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂质体等极小微粒进入细胞。通过与单链抗体融合表达，可以将抗肿瘤的物质靶向输送到肿瘤所在部位，并内化入肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的治疗作用。实验结果表明其具有免疫原性和靶向性，而且内化性效果良好。

本发明提供的在大肠杆菌中表达的基于抗EGFR单链抗体及精氨酸九聚体的融合蛋白，可以利用单链抗体对肿瘤细胞的靶向性和精氨酸九聚体的内化作用，协同其他抗肿瘤分子，实现对肿瘤细胞起到特异性的杀伤作用，效果明显，且毒副作用小，制备简单方便，有良好的应用前景，为肿瘤的治疗提供了一种新的选择。