[发明专利]一种高质量外排体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种高质量外排体及其制备方法，具体地，涉及一种外排体(exosomes)，它是由细胞产生的分泌到细胞外的囊泡，且所述囊泡具有以下特征：a)直径在30‑90nm之间；b)密度在1.11‑1.19g/ml之间；c)含有以下一个或多个特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9。本发明外排体具有均一性好、安全性高的特点，且可通过本发明方法进行大规模制备，从而适应临床需要。

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，尤其涉及一种均一性好、安全性高的外排体以及大规模制备该外排体的方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病。肿瘤免疫治疗是目前对手术、化疗与放疗三大治疗方法的必要补充，也是肿瘤治疗和免疫学研究的热点。随着许多肿瘤特异性抗原及肿瘤相关抗原等的相继发现与鉴定及其人们对抗原递呈机制及T细胞活化机制研究的不断深入，应用多种形式的肿瘤疫苗诱导以机体T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫功能的应用研究得到了迅速的发展。但是，由于大多数肿瘤的免疫原性很弱，因此在特异性免疫治疗过程中，如何运用新型免疫佐剂及抗原递送系统提高肿瘤疫苗的免疫原性、增强肿瘤抗原的抗原递呈、提高免疫效应细胞的杀伤活性是研究的主要方向。

外排体(Exosomes)是细胞所释放的直径为50-100nm的微小的膜性囊泡，成熟的红细胞以外排体的形式将功能所不需要的浆膜蛋白排出细胞外，例如转铁蛋白受体（TfR）或乙酰胆碱脂酶等。通过电镜的深入研究，证实外排体不是由细胞膜直接芽生形成的，而是来源于称为多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）的由内吞过程形成的结构。这种小囊泡出现在MVBs内腔中，很可能是由MVBs内侧面的膜芽生而来。最后通过MVBs与胞浆膜的直接融合，这些小囊泡被释放到细胞外的基质中，即被称为exosome。近年来发现exosome并不仅仅由终期分化的网织红细胞唯一分泌，包括EB病毒转染的B淋巴细胞、T淋巴细胞、肿瘤细胞、抗原递呈细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血小板等均被证明能分泌exosome，其功能也与来源的细胞有关。

目前最受人们关注的是来源于树突状细胞的Exosomes（dendritic cell-derivedExosomes，DEXs)及来源于肿瘤细胞Exosomes（tumor-derived Exosomes，TEXs)。研究表明，Exosomes表达丰富的膜蛋白，包括抗原递呈相关分子如MHC-I,MHC-II,共刺激分子,热休克蛋白分子，介导细胞间粘附的分子如CD11b,ICAM,tetraspanins,lactadherin等，抗原冲击后的DC来源的Exosomes可表达相应的抗原，而肿瘤细胞来源的Exosomes可表达肿瘤相关抗原。自从Raposo等最先报道Exosomes的免疫激活功能后，exosome作为一种非细胞性的抗原递送系统，在肿瘤免疫抗原递呈及肿瘤疫苗研究领域引起了广泛的关注（Raposo G,et al,J Exp Med.1996;183:1161–72）。研究表明，无论是肿瘤抗原冲击DC来源的Exosomes还是肿瘤细胞来源的Exosomes均可在体外激活抗原特异性CTL。而且在体外将抗原肽直接荷载到纯化的Exosomes后，比抗原肽冲击DC来源的Exosomes具有更强的免疫活化潜能（Hsu DH,etal.J Immunother.2003;26:440–50）。