[发明专利]一种高质量外排体及其制备方法

权利要求书

1.一种外排体的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗结肠癌的药物组合物，其中所述外排体是由表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480产生的分泌到细胞外的囊泡，且所述囊泡具有以下特征的组合：

a)直径在30-90 nm之间；

b)密度在1.11-1.19 g/ml之间；和

c)表达以下特征分子：TfR、LAMP、HSP70、HSC70、CD9和肿瘤抗原CEA，且所述外排体无肿瘤克隆形成能力，并且所述外排体通过以下方法产生：

培养表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480，从而制得含有外排体的培养上清液；

所述的外排体通过以下方法分离：

(i) 提供一非连续密度梯度的蔗糖体系，其中，所述蔗糖体系的浓度范围为26%-45%，且所述体系的密度梯度间隔为0.02g/cm³；

(ii) 将所述含有外排体的培养上清液加入所述蔗糖体系并进行离心，其中，离心的转速为100,000×g，离心时间为2小时，从而获得分布于不同密度蔗糖的之间中间层中的外排体粗体；

(iii) 抽取两种不同密度蔗糖的中间层中的所述外排体粗体，并进行洗滤，从而获得所述的外排体；所述肿瘤细胞为表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞；

并且所述的培养上清液的获得步骤为：

(a1) 采用培养液培养表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480；

(a2) 细胞培养至汇聚度60%时，更换含10%不含外排体的小牛血清作为培养基继续培养18-30小时后收集上清液粗体；

(a3) 将(a2)中的上清液粗体经3+0.8μm滤膜过滤，从而获得不含细胞残留物的上清液；

(a4) 将(a3)中的上清液采用500KD的中空膜进行浓缩，并将浓缩产物经PBS和500KD中空膜洗滤，从而获得含有外排体的PBS溶液，即所述的细胞培养上清液。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的外排体的密度在1.11-1.17 g/ml之间。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的表达肿瘤抗原CEA的结肠癌细胞sw480经热休克处理。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在步骤(iii)中，还包括混合或不混合不同密度层中间所抽取的外排体粗体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的洗滤采用PBS通过500KD中空膜至少洗滤3次。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的洗滤采用PBS通过500KD中空膜至少洗滤5次。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(iii)还包括在洗滤后进行滤菌。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的滤菌为采用0.22μm的滤器滤菌。