[发明专利]一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30，还涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的制备方法，还涉及一种能表达口服重组融合蛋白TAT-MAP30的基因工程菌株，以及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的在抗菌、抗病毒中应用。

背景技术

MAP30蛋白

MAP30蛋白（mordtca anti-HIV protein of 30）共由286个氨基酸组成。其基因组由858个碱基构成，其中，包含一个独立的ORF阅读框，无内含子。前23个氨基酸为引导肽，在成熟的发挥功能的MAP30蛋白中没有检测到引导肽序列。

目前，MAP30蛋白能使细菌、病毒、肿瘤细胞的核糖体失活的具体机制尚未得到清晰阐述，但是研究推测，MAP30蛋白的作用机制主要是通过改变DNA的拓扑结构而使核糖体失活，比如对超螺旋DNA的切割作用，将其变为缺口环状及线状DNA，以阻碍蛋白质的合成。

苦瓜蛋白MAP30的生物学活性较多，主要包括以下几方面：抗病毒作用，对艾滋病毒、流感病毒、乙脑病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒等均有抑制作用；抗肿瘤作用，对中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤等均有抑制生长作用；降血糖作用，苦瓜素对于自发性高血糖小鼠，以及诱发性高血糖大鼠均能够起到促进胰岛素分泌，降低血糖浓度，推迟口服蔗糖后血糖升高时间和降低血糖最高峰值的作用；抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有一定的抑菌效果；抗生育作用；免疫原性等。MAP30蛋白的功效很多，还有待进一步探索。

TAT的研究背景

近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域（protein transduction domains,PTD）。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽（Trans-activating transcriptional activator,Tat）。Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。

不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内1h后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。

TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。