[发明专利]羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于羊驼TGF-β1基因的双荧光素酶报告基因载体，以及该载体的构建方法和应用。

背景技术

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是细胞增殖和分化的重要调节蛋白之一，在细胞外基质形成、胚胎发育、创伤愈合及肿瘤发生等过程中起重要作用。在哺乳动物细胞中存在TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型，其中以TGF-β1含量最高，几乎参与了所有的病理和生理过程。TGF-β1在细胞生长和分化、促进成纤维细胞的生长和抑制上皮角朊细胞的生长等方面也起着重要的作用。

MicroRNA（即miRNA）是由18-25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA 3'UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5'端被称为种子序列（Seed Sequence）的7nt序列与位于靶mRNA 3'UTR的miRNA调控元件（miRNA Regulatory Element, MRE）相互作用以识别靶mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3'UTR 区特异性互补配对，抑制靶mRNA 翻译或引起靶mRNA 的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方便广，调控控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。

miR-663在细胞的凋亡、免疫及肿瘤抑制中发挥着重要的作用，比如 miR-663的甲基化与胃癌和乳腺癌的发生相关。而TGF-β1是生物信息学软件预测的miR-663的靶基因之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体。

本发明的第二个目的是提供该羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体的应用。

本发明通过基因工程技术克隆并且构建了羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体，本发明所述的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体包含有双荧光素酶报告基因载体，以及SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊驼TGF-β1基因的3'UTR区。

其中，优选的双荧光素酶报告基因载体为pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression，由美国Promega公司提供。

具体而言，本发明的羊驼TGF-β1-3'UTR双荧光素酶报告基因载体是通过下述方法构建而成的。

根据生物信息学软件Targetscan (http://www.targetscan.org/)、RNAhybrid (http://bibiserv. techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)和RNA22 (http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)，在线预测miR-663与TGF-β1-3'UTR可能的相互结合的靶位点。

通过对GenBank中登录的人、小鼠、牛等哺乳动物的TGF-β1基因序列进行同源性比较，选择保守性高的编码区，以牛基因序列（登录号：NM_001166068）为模板，用primer5软件设计羊驼TGF-β1基因编码区引物，并在上游引物中加入酶切位点Sac I的序列，下游引物中加入酶切位点XbaI的序列，设计出如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特异的TGF-β1-3'UTR引物。

TGF-β1-3'UTR-Sac I-PF：5'CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3'。

TGF-β1-3'UTR-Xba I-PR：5'GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3'。

以TRizol法提取羊驼黑色素细胞总RNA，用上述特异TGF-β1-3'UTR引物扩增，得到具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的TGF-β1-3'UTR基因片段，利用PCR产物纯化试剂盒对得到的TGF-β1-3'UTR片段进行回收。