[发明专利]一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法

说明书

一、技术领域： 

本发明涉及一种微生物的筛选方法技术领域，具体涉及一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。

二、背景技术： 

  β-葡萄糖苷酶 (EC3. 2. 1. 21)，其英文名是 β-glucosidas，是纤维素分解酶系中重要组成成分之一，属于水解酶类，它的特性是可水解结合于未端、非还原性的 β-D-糖苷键，同时释放 β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯 β-D-半乳糖和 β-D-木糖苷。β-葡萄糖苷酶的应用非常广泛，被用来增香、分解纤维质产酒精、改善发酵制品的风味等方面。β-葡萄糖苷酶在很多行业内广泛应用, 具有巨大的商业价值。特别是对于葡萄酒的增香作用更是显著。现今用于酿酒的绝大多数欧亚种 (Vitis vinifera) 葡萄栽培品种的成熟果实闻起来没有明显的特征香气，但是所酿酒都有各品种独特的香气特征。原因是大多数酿酒葡萄品种果实含有的是香气成分的糖苷结合体，人体嗅觉器官无法感知这些不挥发的香气成分糖苷，酿酒过程促进这些香气前体物质的释放水解，挥发出游离香气成分。葡萄酒香气糖苷是香气成分的预备库。比它们对应的游离态成分多好几倍，甚至几十倍。葡萄果粒和酿酒酵母是酿造过程中酶促反应主要酶的来源，但是典型的葡萄酒生产条件，高含糖量高酒精度低PH值和高浓度多酚物质等，限制了葡萄与酿酒酵母中糖苷酶的活性。所以，从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的β-葡萄糖苷酶的酵母菌株,成为得到高产β-葡萄糖苷酶菌株最直接的方法。

   由于产酶微生物种类丰富，数量巨大，所以通过定量测定β-葡萄糖苷酶活性来筛选高产β-葡萄糖苷酶的菌株工作量巨大。 现在研究开发了几种能定性分析或鉴定β-葡萄糖苷酶的显色技术，然后在此基础上进行定量分析，就会大大减少工作量，提高筛选效率。普遍采用的传统初筛方法主要有以下几种： 在聚丙烯酰胺凝胶电泳染色时, 将凝胶保温在对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷溶液中, 会在β-葡萄糖苷酶的位置处出现由硝基酚引起的绿色条带。但其准确性不够, 而且由于硝基酚具有较高的扩散性,其条带会很快逐渐消失。Rissler 利用6-溴-2-萘基β-D-葡萄糖苷为电泳凝胶的保温溶液并以重盐为作用试剂, 酶的降解产物溴萘酚在重盐的作用下形成红色沉淀。由于重盐的感光性, 该技术对操作过程要求苛刻。 使用4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷作为底物, 经β-葡萄糖苷酶作用后分解为4-甲基伞形酮, 利用4-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点进行检测, 因而需要紫外光才能观察，该技术操作复杂。以对硝基苯-β-葡萄糖苷作为底物，经β-葡萄糖苷酶作用后分解为对硝基苯酚，然后加入碳酸钠进行显色反应，产酶的菌株会呈现亮黄色。该方法灵敏度高，快速，但成本昂贵，而且透明圈和培养基的颜色相似因此不便于分辨。上述方法同时只能处理筛选一株菌株，所以筛选产糖苷酶菌株工作量巨大。 

三、发明内容： 

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其根据七叶灵( 6,7-二羟基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原( 6,7-二羟基-香豆素)，七叶苷原能和Fe³⁺作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括以下操作步骤：(1)培养基的配制；(2) 非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3) 单菌落的活化；(4) 在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；(5) 通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。 

所述的步骤（1）培养基的配制：将重量百分比为0.3%的七叶苷，重量百分比为0.05%的柠檬酸铁，重量百分比为0.2%的NaCl，重量百分比为0.05%的MgSO₄.7H₂O，重量百分比为0.1%的KH₂PO₄和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121℃灭菌20min，得培养基； 

所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化：将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；

所述的步骤（3）单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5mL，活化两天；