[发明专利]正青霉属真菌次生代谢产物的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及正青霉属真菌产生的一种次生代谢产物的生物合成方法。

背景技术

微生物作为一个生命体，其体积虽小，但有一套自身特异性的体系，在它的生长过程中有无数酶的参与，如合成酶、水解酶、异构酶、氢化酶、还原酶等，微生物学的研究者将这一特性应用于实际的实验和生产中，例如在生物转化中利用微生物自身的酶体系产生的酶对加入的其中底物发生作用，使其结构发生变化，从而解决了很多化学上无法合成的反应化学；又如食醋是人们日常生活所必需的调味品，也是最古老的利用微生物生产的食品之一，其生产是利用醋酸菌在充分供氧的条件下将乙醇氧化为醋酸。

日常饮用的发酵乳制品主要由干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、植物乳杆菌（L.plantraum）、瑞士乳杆菌（L.heltyieus）、乳酸乳杆菌（L.lactis）、乳链球菌（Streptococcuslactis）等发酵而来。嗜柠檬酸链球菌还可以把柠檬酸代谢为具有香味的丁二酮等，使乳制品具有芳香味。

微生物在生长过程中还可以代谢出一种或多种次级代谢产物，并且不同的外界环境可以影响微生物的代谢，例如气压，培养基的种类，培养基内加入的营养成分，均可以影响微生物次级代谢产物的生成及其产物的含量。此外，生物转化中经常用到的某些助溶剂如二甲基亚砜（DMSO）等对某些特定菌株的生长代谢及其次级代谢产物的生成也会产生影响。

本发明的发明人在筛选能够对某种底物进行转化的菌株过程中偶然发现，未加入助溶剂DMSO的某种菌体空白对照和加入DMSO的该菌体空白对照在菌液颜色、代谢产物等方面均有所不同。由此，为了验证和阐明DMSO对该菌种的影响，我们对其进行重复验证试验后确认了这种影响，并选择其它的小分子溶剂，如丙酮、DMF、乙醇等对该菌株进行诱导试验，结果表明：对于该菌株而言，只有加入DMSO或丙酮后有相似的影响，并对产生的次生代谢产物进行了分离纯化及结构鉴定。

经查阅相关文献，仅有一篇文献（TetrahedronLetters1998,39,7733-7736.）对本发明得到的化合物进行过报导，但其生物合成是通过基因重组而非简单的小量溶剂诱导，且得到的该化合物并非单一的纯品6,8-二羟基-3-(4-羟基-2-氧代戊基)-1H-异色烯-1-酮，而是与其异构体6,8-二羟基-3-(2-羟基-4-氧代戊基)-1H-异色烯-1-酮的混合物，二者的结构如下所示。

本发明的发明人采用了简便的实验方法，首次得到了化合物6,8-二羟基-3-(4-羟基-2-氧代戊基)-1H-异色烯-1-酮的单一纯品，简化了该化合物的生物合成方法，同时也为通过生物合成方法获得特定的新型天然产物提供了可行性途径。

发明内容

本发明利用DMSO、丙酮等极性有机溶剂作为诱导剂来刺激菌株产生特定的次级代谢产物。经过扩大培养菌株，纯化该次级代谢产物并对其进行结构鉴定，最终验证了本方法的可行性。同时，本发明对DMSO的加入量、加入时间等参数进行了研究，并考察了其它溶剂是否具有类似的诱导作用。

本发明通过以下技术方案实现：

（1）菌株筛选；

在绿色木霉（Trichodermavirde）、杂色曲霉变种（Asperigllusversicolor var.versicolor）等23种菌株中分别加入小量DMSO，筛选出了一株能够产生新的代谢产物的菌株，经鉴定之后为一种正青霉属的真菌（Eupenicilliumsp.）。

（2）菌株培养；

从斜面挑取菌落置于培养基内，30℃，110rpm摇床培养，48h之后加入0.2mlDMSO进行诱导，使其产生该次级代谢产物，并分析了不同浓度，不同时间加入DMSO对菌体的影响，培养时间对代谢产物的影响，其它溶剂对菌株的诱导作用等。

（3）目标产物分离、纯化。

抽滤菌液，滤液用乙酸乙酯萃取2～3次，减压去除溶剂，选用200-300目硅胶在石油醚：乙酸乙酯=3:1的洗脱体系下对该次级代谢产物进行分离纯化，并进行结构鉴定，确定该化合物的结构为：

因此，本发明的目的在于提供一种与现有技术相比更加简便的生物合成方法。通过该方法可以诱导正青霉属真菌产生一种特定的异色烯类化合物，其结构如上所示。具体而言，本发明的方法包括如下步骤：