[发明专利]一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

凝血酶（thrombin）是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋白原的肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血的目的。由于其止血快，无副作用等优点，广泛应用于创伤和临床手术创面以及消化道粘膜等部位的出血与渗血，止血效果好，疗效确切。然而，普通凝血酶是一种蛋白酶类试剂，容易受光线、温度、湿度，特别是微生物的污染因素影响而导致生物活性下降甚至丧失。在常温下，凝血酶的水溶液在保存24天后就完全失活。稳定性较差，使其应用受到了一定限制。

利用丰富的可降解高分子纳米材料固化包裹凝血酶，制备凝血酶纳米颗粒，可大大减少光线、温度、湿度等对凝血酶的影响，从而提高凝血酶的稳定性。目前开发出一些包载凝血酶药物，但有的包载凝血酶的载体需溶于有机溶剂中来制备包载凝血酶，有的包载凝血酶的载体溶液呈酸性，有的包载凝血酶需在高温下制备，而有机溶剂、酸性溶液、高温对凝血酶的活性均有较大影响，从而降低制得的包载凝血酶的药效。

因此，目前很有必要开发一种对所包载的凝血酶的活性无较大影响，稳定性好、安全高效、使用范围广泛的凝血酶新剂型。

发明内容

为了克服现有技术中包载凝血酶药物的药效低、溶解度低、毒性大的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法；

本发明的另一目的在于提供上述制备方法得到的可溶解凝血酶纳米颗粒；

本发明的再一目的在于提供上述可溶解凝血酶纳米颗粒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，包括以下操作步骤：

（1）通过点击化学合成直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒；

（2）将直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液；

（3）将凝血酶加入至pH6.0～8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；

（4）将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，加入交联剂至质量浓度为0.01～0.10%，升温至30～50℃，以100～800转/分钟的速度搅拌20～60分钟，将其倾倒入至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至质量浓度为1～10%，以300～1500转/分钟的速度高速搅拌2～8小时进行乳化，得到乳化液；

（5）向步骤（4）所得乳化液中加入交联剂至交联剂质量浓度为0.5～5.0%，搅拌20～60分钟，使其分散均匀，置于30～50℃水浴中进行交联8～12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；

（6）过滤物用丙酮洗涤，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒；再以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；

（7）将固态纳米微球在10～40℃温度下真空干燥，得到可溶解凝血酶纳米颗粒。

步骤（1）所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒分子量在200-300kDa之间；所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒按照以下制备步骤得到：

（1）通过酰胺化反应合成第一代树枝状聚赖氨酸：将1.73g L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸和5.5mmol丙炔胺共溶在20mL无水DMF中，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃，再加入2.18g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.74g1-羟基苯并三氮唑，继续在室温下搅拌16h，反应结束后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化（硅胶，氯仿-甲醇=5:1），然后旋转蒸发可获得质量分数90%的第一代树枝状聚赖氨酸；