[发明专利]一种可溶解凝血酶纳米颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种可溶解凝血酶纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

（1）通过点击化学合成直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒；

（2）将直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒加入到乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解，形成直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液；

（3）将凝血酶加入至pH6.0～8.0缓冲液中，搅拌溶解，形成凝血酶缓冲溶液；

（4）将凝血酶缓冲溶液加入到直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中，加入交联剂至质量浓度为0.01～0.10%，升温至30～50℃，以100～800转/分钟的速度搅拌20～60分钟，将其倾倒入至液体石蜡中，搅拌，再加入分散剂至质量浓度为1～10%，以300～1500转/分钟的速度高速搅拌2～8小时进行乳化，得到乳化液；

（5）向步骤（4）所得乳化液中加入交联剂至交联剂质量浓度为0.5～5.0%，搅拌20～60分钟，使其分散均匀，置于30～50℃水浴中进行交联8～12小时，将产物冷却至室温，取出，进行过滤；

（6）过滤物用丙酮洗涤，使得丙酮表面无漂浮油斑，即得凝胶状半透明纳米微粒；再以乙醇洗涤脱水，即得固态纳米微球；

（7）将固态纳米微球在10～40℃温度下真空干燥，得到可溶解凝血酶纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒分子量在200-300kDa之间；所述直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒按照以下制备步骤得到：

（1）通过酰胺化反应合成第一代树枝状聚赖氨酸：将1.73g L-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸和5.5mmol丙炔胺共溶在20mL无水DMF中，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃，再加入2.18g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.74g1-羟基苯并三氮唑，继续在室温下搅拌16h，反应结束后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数90%的第一代树枝状聚赖氨酸；

（2）合成第二代树枝状聚赖氨酸：在室温下，称取0.96g第一代树枝状聚赖氨酸溶解在15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，反应2h后，真空去除溶剂；加入30mL无水DMF，随后加入4mL三乙胺和1.75gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，再加入2.48g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和0.86g1-羟基苯并三氮唑，在室温下搅拌24h，反应结束后，加入250mL乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃溶液、0.1mol/L的NaHSO₄、饱和NaHCO₃溶液和卤水依次冲洗，之后通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数63%的第二代树枝状聚赖氨酸；

（3）合成第三代树枝状聚赖氨酸：称取1.12g第二代树枝状聚赖氨酸，加入20mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除L-2,6-二叔丁氧羰基，将获得的固体加入40mL无水DMF，随后加入6mL三乙胺和2.08gL-2,6-二叔丁氧羰基赖氨酸，在通氮气下搅拌10min，接着冷却至0℃；反应结束后，通过旋转蒸发干燥，将获得的粗制产物通过柱层析法纯化，然后旋转蒸发可获得质量分数60%的第三代树枝状聚赖氨酸；

（4）称取0.515g第三代树枝状聚赖氨酸，加入15mL三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中，在室温下静置2h后去除残留的L-2,6-二叔丁氧羰基；将溶剂蒸发后，加入0.05g直链淀粉和10mL二甲基亚砜进行溶解；在通氮气下，加入18mgCuSO₄·5H₂O和65mg抗坏血酸钠，并将混合溶液加热至40℃恒温48h，反应结束后，将产物在蒸馏水中透析3d，冻干后可获得质量分数65%的直链淀粉-聚赖氨酸纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）～（4）所述三氟乙酸-二氯甲烷混合溶液中三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述乙酸水溶液的质量浓度为0.5～2.5%；所述直链淀粉-聚赖氨酸乙酸水溶液中直链淀粉-聚赖氨酸的质量浓度为0.5～8%。