[发明专利]一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，尤其涉及一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置。 

背景技术

由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径，因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。 

例如FED（fluorescent emission difference），公开号为102735617A的专利文献提供了一种超分辨显微方法，首先一束光经显微物镜聚焦，在样品上形成一个实心光斑，该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。实心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第一信号光强I₁；再利用另一束调制后光束经显微物镜聚焦在样品上，形成的光斑为一个面包圈型的空心光斑。该空心光斑照射范围内的样品所发出的信号光被探测器所收集，得到当前扫描点处的第二信号光强I₂。利用公式I(x,y)=I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算得到I(x,y)，显然I(x,y)所对应的各扫描点处的有效信号光发光面积将小于I₁(x,y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。 

与常规光学显微方法相比，FED减小了有效信号光的发光面积，并实现超衍射极限的分辨率，但这种方法的局限性在于，每次只能对单点进行成像。 

发明内容

本发明提供了一种基于宽场受激发射差分的显微方法和装置，首先对样品进行宽场照明并成像，然后利用激光经两个渥拉斯顿棱镜形成两束垂直偏振光（s光）和两束平行偏振光（p光），这四束线偏光聚焦形成的干涉光斑对荧光样品进行照明并成像，然后同FED类似对宽场下得到的图像和干涉光斑下得到的图像进行差分处理，由于暗斑的大小小于衍射极限，所以能够得到暗斑中的超分辨图像，最后通过扫描振镜控制干涉光斑在样品上移动，以得到样品全部的显微图像。本发明装置结构简单，便于操作，能够实现基于宽场受激发射差分的快速超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。 

一种基于宽场受激发射差分的显微方法，针对荧光样品包括以下步骤： 

（1）第一激光器发出激光，经第一透镜准直后，得到准直光束；所述准直光束经第一双色镜全部反射后，形成第一反射光；所述第一反射光再经第二双色镜全部透射，形成照明光；所述照明光经扫描振镜系统后汇聚到物镜的后焦面，最后经物镜照射到荧光样品表面，对荧光样品进行宽场照明； 

（2）所述样品发出荧光，被物镜收集，再经扫描振镜系统和第二双色镜全部反射，最后经滤波片过滤杂散光，被探测器接收得到宽场照明下的样品图像； 

（3）第二激光器发出光束；所述光束经第一渥拉斯顿棱镜得到两束分开的，角度、振动方向互相垂直的第一线偏光和第二线偏光；所述第一线偏光经第二渥拉斯顿棱镜得到第一平行偏振光（p光）和第一垂直偏振光（s光）；所述第二线偏光经第二渥拉斯顿棱镜得到第二平行偏振光（p光）和第二垂直偏振光（s光）；所述第一平行偏振光（p光）、第一垂直偏振光（s光）、第二平行偏振光（p光）、第二垂直偏振光（s光）经第二透镜，第一双色镜，第二双色镜全部透射后得到四束线偏光； 

（4）所述四束线偏光经扫描振镜系统后汇聚到物镜的后焦面，最后经物镜聚焦到荧光样品表面，形成干涉光斑，其中干涉光斑的亮斑部分对 荧光样品进行照明； 

（5）四束线偏光形成的干涉光斑如图2所示，其中两亮点的最小距离为D=λ/2NA，NA为物镜的数值孔径； 

（6）所述样品发出荧光，被物镜收集，再经扫描振镜系统和第二双色镜全部反射，最后经滤波片过滤杂散光，被探测器接收得到干涉光斑照明下的样品图像； 

（7）对得到的两幅图进行差分处理，就可以得到干涉光斑中暗斑部分的显微图像； 

（8）通过计算机控制扫描振镜系统实现干涉光斑在样品表面的移动，以得到完整的样品图像； 

本发明还提供了基于宽场受激发射差分的显微装置，针对荧光样品包括： 

第一激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的宽场照明； 

第二激光器，用于发出激光，实现对荧光样品的照明； 

在所述第一激光器发出照明光光路的光轴上设置的第一透镜；