[发明专利]一种基因测序的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基因测序的方法。 

背景技术

DNA测序（DNA sequencing）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的排列方式。快速，准确和低廉的DNA测序方法将极大地推动生物学和医学的研究和发现。现在，已经可以测定了包括人类基因组和其他许多动物、植物和微生物物种的完整基因序列，有助于更深入地了解生命的本质。临床上，许多和疾病有关的基因测定则让医护人员更好地诊断和治疗病患，逐渐体现基因测序的巨大应用前景。 

早在1977年， Sanger等发明双脱氧链末端终止法。同时的Maxam和 Gilbert则发明了化学降解法进行碱基序列的测定。第一代DNA测序仪器使用的是Sanger的方案。后来经过改进成为四色荧光，利用毛细管电泳的高度自动化测序系统。第一代DNA测序仪的产生具有划时代的意义，90年代美国的人类基因组计划就是利用大规模的Sanger测序仪获得第一个完整的人类基因组。由于其准确性高，所以作为基因组的参照序列而被采用。 

但是第一代DNA测序仪器的消耗成本巨大，样品通量小，导致测序花费时间长。要花数十亿美元的资金，上万的科研人员和超过十年的时间才能获得一个人的完整基因，所以在应用上受到很大的限制。 

进入21世纪后，陆续出现了更为强大的第二代基因测序技术。主要是Roche公司的焦磷酸测序法，Illumina公司的DNA合成终止法测序以及Life Technologies公司的DNA连接测序法。这些公司利用商业化提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，可以将获得一个人的基因组的时间缩小到数周，成本只需要数十万美元左右。 

但是现有的基因测序技术存在如下问题：（1）Roche公司的方法对连续相同序列的DNA测序准确率差，因为其方法没有采用合成终止技术，而且需要利用多种酶，效率低，成本高，已逐渐被市场淘汰；（2）Life Tech公司的DNA连接测序缺点是使用连接酶而不是聚合酶，所以准确率不好，而且成本很高；（3）Illumina公司比上述两个公司的方法更好，其主要缺点是利用４种荧光分子，成本高，装置复杂，而且每个测序周期都会在DNA链上留下多余的残留分子。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于基因测序的方法，该方法简化了合成步骤，且成像装置较为简单，成本低；而且采用的荧光标记核酸荧光分子只有3种，每个测序周期都不会在DNA链上留下多余的残留分子，不会影响DNA聚合酶与待测的DNA链的结合，可以大幅度地提高测序准确率和读长。 

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种基因测序的方法，利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，以该方法为基础重新定义了基因测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。 

该方法采用三色荧光边合成边测序，与目前市场主流的四色荧光测序仪有本质的区别。 

作为本发明的一种优选的实施方案，本发明提供的基因测序的方法，具体含以下步骤： 

（1）合成一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记核酸分子和一种无荧光标记核酸分子，所述的三种荧光标记核酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种即为无荧光标记的核酸分子；

（2）将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 

（3）将互补的DNA引物与连接有待测DNA的通用的DNA序列配对，并且引物上设有3’-OH官能团； 

（4）利用DNA聚合酶，将上述荧光标记核酸加入到引物的3’-OH上，获得待测样品； 

（5）使用3种不同波长的激光分别先后照射待测样品，每种激光会激发相应的荧光基团，并且产生相应的荧光，通过显微镜成像系统，信号通过3种不同的滤波片，读出每段DNA上带有的不同荧光信号，其中3种不同波长的激光为波长之间差别在30nm以上的激光；

（6）化学切除保护基团，引物3’-OH上的-N₃，以及荧光分子和碱基之间的-N₃；

（7）进行下一轮的测序，测得引物的DNA序列，从而测得待测DNA的序列。

本发明步骤（1）中采用的一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记的核酸分子A，C和G，以及一种无荧光标记的核酸分子T，各核酸分子的结构式如下：