[发明专利]一种基因测序的方法

权利要求书

1.一种基因测序的方法，其特征是：利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，以该方法为基础重新定义了基因测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。

2.根据权利要求1中的基因测序方法，其特征是包含以下步骤：

（1）合成一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记核酸分子和一种无荧光标记核酸分子，所述的三种荧光标记核酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种即为无荧光标记的核酸分子；

（2）将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 

（3）将互补的DNA引物与连接有待测DNA的通用的DNA序列配对，并且引物上设有3’-OH官能团； 

（4）利用DNA聚合酶，将上述荧光标记核酸加入到引物的3’-OH上，获得待测样品； 

（5）使用3种不同波长的激光分别先后照射待测样品，每种激光会激发相应的荧光基团，并且产生相应的荧光，通过显微镜成像系统，信号通过3种不同的滤波片，读出每段DNA上带有的不同荧光信号，其中3种不同波长的激光为波长之间差别在30nm以上的激光；

（6）化学切除保护基团，包括引物3’-OH上的-N₃，以及荧光分子和碱基之间的-N₃；

（7）进行下一轮的测序，测得引物的DNA序列，从而测得待测DNA的序列。

3.根据权利要求2所述的基因测序方法，其特征是：步骤（1）中采用的一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记的核酸分子A，G和C，以及一种无荧光标记的核酸分子T，各核酸分子的结构式如下：

    (A)

(G)

            (C)

                                (T)。

4.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征是：所述的荧光分子1为rhodamine X或Alexa Fluor 594，所述的荧光分子2为Cy5或Alexa Fluor 647，所述的荧光分子3为BOIDIPY-FL或Alexa Fluor 488。

5.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征是：所述的荧光标记核酸分子C通过以下合成工艺制得： 

在上述合成工艺中，各步骤代表的反应过程如下：

（1）选取起始原料1胞嘧啶，其5’-OH被硅保护，3’-OH被叠氮甲基保护，将原料与条件（i）中的三乙胺TEA、二氯甲烷DCM以及酰氯化合物反应，形成碱基被修饰的产物2；

（2）将产物2与条件（ii）中的四正丁基氟化铵TBAF反应，5’-OH的硅保护被去掉，形成碱基被修饰的产物3；

（3）将产物3与条件（iii）中的三氯氧磷POCl₃、磷酸三甲酯(MeO)₃PO、丁基胺二氢焦磷酸BuNH₂H₂P₂O₇、三乙胺碳酸氢盐TEAB和三丁胺Bu₃N反应，形成5’-OH的三磷酸产物4；

（4）将产物4与条件（iv）中的哌啶piperidine、二甲基甲酰胺DMF反应，脱掉芴基保护集团，形成含有氨基的产物5；

（5）将产物5与条件（v）中的荧光分子3，在浓度为0.1mol/L、pH为8~9的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液中反应，形成含有荧光基团的最终产物6，即为所述的核酸分子C；

所述的核酸分子A和核酸分子G的合成过程同核酸分子C。

6.根据权利要求1或2所述的基因测序方法，其特征是：所述3种不同波长的激光，激光波长为任意三种可见光波段的、与荧光分子对应的、彼此相差30纳米以上的激光组合。

7.根据权利要求6所述的基因测序方法，其特征是：所述3种不同波长的激光，所述激光的波长为488nm，568nm和643nm；或512nm，568nm和633nm。