[发明专利]香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法。

背景技术

香蕉是仅次于水稻、小麦和玉米的全世界第四大粮食作物；据FAO统计，近10年全世界香蕉种植面积呈增长的趋势，2007年种植面积达6615.75万亩，产量达到8000多万吨，而中国的面积为450多万亩，居第五位，产量达到700多万吨，居第二位。但是，该产业的发展正受到病害的毁灭性威胁，特别是毁灭性病害香蕉枯萎病和细菌性软腐病等。香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC）（Wang Z Z et al，2006），有4个生理小种；其中4号生理小种（FOC4）能感染几乎所有的香蕉品种，其危害性最大（Liu J M et al，2006）。目前，FOC4已严重危害澳大利亚、菲律宾和我国台湾等地的香蕉生产（漆艳香等，2008）；1996年，广东番禺也发现巴西香蕉感染枯萎病，并鉴定为FOC4。目前，以FOC4为主要病原菌的香蕉枯萎病在广东省主要香蕉种植基地迅速蔓延，对香蕉产业造成重大危害。此外，FOC1也是我国香蕉枯萎病的重要病原菌，如严重危害我国华南香蕉产区的粉蕉的枯萎病就是由1号生理小种FOC1侵染引起的（彭埃天等，2009）；该病原菌可感染香蕉栽培种“大蜜啥”（Gros Michel（AAA））、龙牙蕉（MusaAAB）和矮香蕉（Dwarf Cavendish（AAA））等，且该生理小种呈世界性分布。香蕉细菌性软腐病则于2009年7月广东广州首次发现，这是在中国大陆首次发现该毁灭性病害，田间发病率20%～30%，严重可达100%以上，并造成整株死亡；病原菌经鉴定为Dikeya sp.（Lin et al，2010）。但由于该病害报道时间较短，尚未有关于病害监测技术的系统报道。

该两种病害主要通过种苗传播，病害潜伏期长，一旦出现症状，香蕉已经面临死亡状态危害严重。但是，由于以下原因使得病情的判断不准确或者耗时较长，无法制定准确的防治措施或者延误最佳防治时机；第一，香蕉细菌性软腐病初期发病症状和香蕉枯萎病有些相似，根据病状较难判断，而传统的病原菌分离培养鉴定的方法耗时耗力，且同时依赖专业人员的扎实植物病理学背景；第二，香蕉枯萎病和细菌性软腐病经常可复合感染香蕉植株，造成严重危害。然而，目前国内外关于香蕉主要病害的检测技术均是单项技术，如“香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种检测引物和快速检测方法”（申请号：201010181211.1）和“香蕉细菌性软腐病害病原菌分子快速检测的方法与应用”（申请号：201110003516.8）。以上技术均只能单独检测香蕉枯萎病和细菌性软腐病菌。因此，在实际农业生产中，关于香蕉重要病害检测、监测及防治等，由于检测过程较为耗时、耗工和耗钱，容易错过农时，不符合生产实际要求。为防止香蕉枯萎病和细菌性软腐病的扩散与蔓延，确保香蕉的安全生产，建立一套稳定、简便、快速、灵敏的分子检测方法对种苗及种植区的土壤进行检疫检测是非常必要的。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法。

本发明根据香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种的基因组差异序列设计一对可同时检测出香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种的特异引物，仅使用一对引物可同时鉴定香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种；同时，根据Dickeya属的gyrB基因序列设计新引物，可特异检测该属病原菌。

该方法操作简便易行，可以以试剂盒的形式直接应用于生产实践，用于带菌的植物组织或土壤的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。

本发明的另一目的在于提供一种所述香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法的应用。

香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及香蕉细菌性软腐病菌的多重分子快速检测的方法，即利用聚合酶链式反应（PCR）分子生物学技术对香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及香蕉细菌性软腐病菌进行高灵敏度快速检测，可用于香蕉种苗检疫、土壤病原菌检测、田间香蕉病害的早期诊断以及病菌的鉴定和监测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，包括以下步骤：

（1）提供两对检测引物，见表1所示：

表1香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种及细菌性软腐病菌检测特异引物