[发明专利]香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法

权利要求书

1.一种香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提供两对检测引物，如下所示：

香蕉枯萎病菌上游特异引物Foc-F：5'-TTCGGCGATAACTTCAATGTCA-3'；

香蕉枯萎病菌下游特异引物Foc-R：5'-TGGGTTGCGGATTCGCTATT-3'；

细菌性软腐病菌上游特异引物GyrB-F：5'-AATACGACATTCTGGCTAAGCG-3'；

细菌性软腐病菌下游特异引物GyrB-R：5'-GATTTCCACGCCGATATTGTCT-3'；

（2）对样本进行处理，抽提样本DNA；

（3）以样本DNA为模板，使用香蕉枯萎病菌上游、下游特异引物和细菌性软腐病菌上游、下游特异引物进行多重PCR扩增反应；

（4）将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；当PCR产物呈现636bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌1号生理小种病原菌；当PCR产物呈现796bp条带时，即样本中含有香蕉枯萎病菌4号生理小种病原菌；当PCR产物呈现218bp条带时，即样本中含有细菌性软腐病原菌。

2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的样本为香蕉病原菌时，所述处理的方式为利用FPCB solution抽提培养过滤后的真菌菌丝的DNA；利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。

3.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：所述的过滤为用擦镜纸或滤纸进行过滤。

4.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的样本为香蕉植株组织时，所述处理的方式为利用CTAB法抽提香蕉植株组织中的DNA。

5.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的样本为土壤时，所述处理的方式为使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒提取疑感染的土壤DNA。

6.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的多重PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法，其特征在于：

步骤（3）所述的多重PCR扩增反应的体系20μL如下：DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR buffer2μL，2.5mM的dNTP1.6μL，10μM的Foc-F0.3μL，10μM的Foc-R0.3μL，10μM的GyrB-F0.3μL，10μM的GyrB-R0.3μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，ddH₂O14μL，共20μL。

8.权利要求1～7任一项所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法应用于香蕉种苗检疫、土壤病原菌检测、田间香蕉病害的早期诊断以及病菌的监测和鉴定。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的多重分子快速检测方法应用于香蕉患病组织的检测，患病组织上直接分离的病原真菌或细菌的鉴定及检测，土壤中香蕉枯萎病菌不同生理小种、细菌性软腐病菌的检测。