[发明专利]基因DNA序列捕获探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种可用于多个目标基因序列进行捕获后进行二代测序的探针制作方法。

背景技术

新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研究打开了新的局面，使得普通实验室对整个人类基因组进行测序成为可能，然而全基因组测序的实验成本和对科研人员的分析能力的要求还是很高，而且由于大部分基因的功能还不是很清楚，对所产生的海量数据进行生物信息学分析将是一项巨大的挑战。

在新一代测序技术以前，人们对基因组大片段特定区域的研究主要通过PCR walking后进行传统毛细管测序的方法。这种方法的问题是目标片段大于500kb时PCR和测序的成本会变得让研究人员难以承受。而传统的单基因疾病的解决方案是家系连锁定位，最后定位的区域往往是以兆（M）bp来计算的，这就为后续的研究工作带来了困难。

随着新的研究方法的产生，目标序列捕获、全外显子捕获等方法能更加经济有效的靶定基因组的相应区域。而且这些方法产生的大量DNA片段非常适合使用新一代测序平台进行测序。通过这些技术的组合，人们对于遗传疾病的研究的效率大大的提高。

分子诊断市场无比广大，但是诊断市场对成本的要求更为苛刻，至少全基因组测序在很长的一段时间内无法进入分子诊断市场，这就是目标序列捕获测序的机会。例如DMD基因，长度2500kb，由79个外显子和78个内含子构成，其突变是引起杜氏进行性肌营养不良病的原因，非常适合采用靶向测序。还有一些遗传病在表型上非常相似，但可能是目前已知基因变异的一种，这样我们也可以把这些变异区域并在一起，设计目标序列探针并捕获测序，这比传统的PCR后毛细管测序通量高，速度快，深度深。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对目标基因进行有效捕获的探针的制作方法。应用该方法能够实现对多个靶基因区域同时进行快速高效地捕获，以更快更有效地锁定致病位点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因DNA序列捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

一、制备接头：

1）、设计两条部分互补的引物，所述两条引物之间的互补度为30～50%（较佳为35～45%，进一步较佳为40%）；其中一条引物中含有T7启动子序列且该条引物的5’末端有一个突出的T；

2）、配制反应液进行反应：

共100μl，混匀；

反应条件为：将上述混合液进行94℃保温10分钟，然后取出进行缓慢冷却至室温（即，0.8～1.2小时内冷却至室温）实现退火；从而形成一个部分双链结构的开叉形接头；

备注说明：在本发明中，室温是指15～25℃；

二、将上述部分双链结构的开叉形接头与目标基因的普通PCR扩增产物（A1）进行连接反应，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

所述反应体系为：

反应条件为16℃，1小时，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

三、针对部分双链结构的开叉形接头序列设计相应的引物-----2个通用引物，对所述两端带有接头的目标基因（A2）进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物（A3）；

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共15个循环；然后72℃额外延伸10分钟，将所得的带有T7启动子的扩增产物（A3）4℃保存；

四、对上述带有T7启动子的扩增产物（A3）进行定量后，加入带有生物素标记的NTP(其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记)，进行体外转录反应，最终得到基因DNA序列捕获探针（带有生物素标记的RNA探针）。

作为本发明的基因DNA序列捕获探针的制备方法的改进：

所述步骤四中：

将扩增产物（A3）定量至浓度为22.6ng/μl；

体外转录体系为：

加去离子水至总体积40μl；

混匀后于37℃，反应15小时；所得产物纯化，得基因DNA序列捕获探针。

备注说明：酶、缓冲液及带有生物素标记的NTP可以从生命技术公司（life technology公司）购得，产品货号为AM1791。

其中UTP上标记生物素，其他ATP，CTP，GTP不标记。

作为本发明的基因DNA序列捕获探针的制备方法的进一步改进：

所述步骤一中：