[发明专利]基因DNA序列捕获探针的制备方法

权利要求书

1.基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：

一、制备接头：

1）、设计两条部分互补的引物，所述两条引物之间的互补度为30～50%；其中一条引物中含有T7启动子序列且该条引物的5’末端有一个突出的T；

2）、配制反应液进行反应：

共100μl，混匀；

反应条件为：将上述混合液进行94℃保温10分钟，然后取出进行缓慢冷却至室温实现退火；从而形成一个部分双链结构的开叉形接头；

二、将上述部分双链结构的开叉形接头与目标基因的普通PCR扩增产物（A1）进行连接反应，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

所述反应体系为：

反应条件为16℃，1小时，从而得到两端带有接头的目标基因（A2）；

三、针对部分双链结构的开叉形接头序列设计相应的引物-----2个通用引物，对所述两端带有接头的目标基因（A2）进行扩增，得到带有T7启动子的扩增产物（A3）；

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共15个循环；然后72℃额外延伸10分钟，将所得的带有T7启动子的扩增产物（A3）4℃保存；

四、对上述带有T7启动子的扩增产物（A3）进行定量后，加入带有生物素标记的NTP，进行体外转录反应，最终得到基因DNA序列捕获探针；

所述NTP中，UTP上标记生物素，ATP、CTP、GTP不标记。

2.根据权利要求1所述的基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是：

所述步骤四中：

将扩增产物（A3）定量至浓度为22.6ng/μl；

体外转录体系为：

加去离子水至总体积40μl；

混匀后于37℃，反应15小时；所得产物纯化，得基因DNA序列捕获探针。

3.根据权利要求1或2所述的基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是：

所述步骤一中：

4.根据权利要求3所述的基因DNA序列捕获探针的制备方法，其特征是：

所述步骤三中：

通用引物1:ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT

通用引物2:CGGCTTAATA CGACTCACTA TAGGGATCGC。