[发明专利]一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用动物器官制备高纯度硫酸软骨素的技术，尤其是一种利用兔耳软骨制备高纯度硫酸软骨素A的方法。

背景技术

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，CS）是一种硫酸多糖类物质，以蛋白聚糖形式广泛存在于各种动物组织和器官中，具有多种生理作用。生物组织中的硫酸软骨素，主要有硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素B(CSB)和硫酸软骨素C(CSC)，其中：CSA是由葡糖醛酸（GlcA）以β-1,3-糖苷键与4-硫酸-乙酰氨基半乳糖(GalNAc4S)以β-1,4-糖苷键交替连接而成。硫酸软骨素A具有很好的抗炎、降血脂等生理活性，在临床中广泛应用。我国是硫酸软骨素生产和出口大国，从猪、牛、鸡等软管中提取的硫酸软骨素占世界市场的80%以上。随着老龄人口数量不断增长，骨关节炎患者逐年增多，全球硫酸软骨素的市场需求量很大，仅美国每年硫酸软骨素用量达600多吨。中国有13亿人口，加之近年来硫酸软骨素开始应用于抗凝抗血栓、口腔黏膜溃疡、滴眼液、口服保健品、某些神经性头痛、化妆品行业以及组织工程中等，应用领域不断扩大，市场前景十分广阔。近年来研究表明，硫酸软骨素在抗寄生虫和病毒感染、再生医学、抗肿瘤等领域也有很大的应用潜力。

目前，市场上硫酸软骨素多来自于猪、牛、羊、鸡等动物的软骨、喉骨、气管等组织，由于来源不同，硫酸软骨素质量很难控制。我国药用硫酸软骨素有硫酸软骨素A钠和供注射用的CSA，来源为猪喉骨、鼻骨和气管等软骨组织。近年来，猪流感、猪口蹄疫、猪蓝耳病等疾病时有发生，极有可能会对其来源的硫酸软骨素的应用受到限制。

在CSA制备方面，中国专利申请（公开号CN102898541A）涉及用鱼骨提取硫酸软骨素的方法，虽然来源于鱼类的硫酸软骨素与陆生动物相比，受污染程度很小，但是其二糖重复单元中C-4位硫酸酯基和C-6位硫酸酯基比例与药用硫酸软骨素A差别较大。中国专利申请（公开号CN102850466A）披露了牦牛骨制取硫酸软骨素的方法，由于牦牛分布具有明显的地域性，相比之下原材料难以获得。中国专利申请（公开号CN102690372A）涉及一种用鸡骨架生产硫酸软骨素的方法，同样由于禽流感的频繁流行，鸡来源的产品也存在一定安全隐患。此外，现有专利所得硫酸软骨素还存在纯度不高及不能直接作为药用的缺点。

从利用动物组织中提取安全、卫生、无害的医药级硫酸软骨素，成为近几年业界关注的焦点。随着家兔养殖业的发展，大量兔耳被作为各种普通食品被人们食用，兔耳软骨中含有大量硫酸软骨素，是一种优良的硫酸软骨素原料，经国内外专利检索表明，目前还没有从兔耳中制备硫酸软骨素的报导。充分利用兔耳资源，从中提取医药级硫酸软骨素，可延伸家兔养殖业产业链。

发明内容

针对现有技术制备硫酸软骨素A中存在的不足，本发明的目的在于提供一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法可有效利用兔肉加工废料兔耳，获得纯度高的硫酸软骨素A，能弥补市场对来源安全的药用硫酸软骨素的大量需求。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：

一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法包括以下步骤：

(1)脱脂：将新鲜兔耳剥皮、去肉后得兔耳软骨，有机溶剂浸泡，取出软骨干燥后粉碎，得脱脂软骨粉；

(2)酶解：脱脂软骨粉用Tris-HCl缓冲液浸泡，煮沸后降温至37℃，加入胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解后煮沸使酶灭活；

(3)乙醇沉淀：将(2)所得酶解液离心，上清液加入乙醇沉淀，离心后取沉淀加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得软骨素粗提产物；

(4)纯化：将(3)所得软骨素粗提产物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度氯化钠水溶液为流动相，经过Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有硫酸软骨素A组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到硫酸软骨素A。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，该方法获得硫酸软骨素A的分子量为16～59kDa。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(1)中，加入兔耳软骨的10～20倍体积有机溶剂，采用浸泡脱脂2～8h和/或采用有机溶剂浸泡和间歇搅拌配合脱脂2～8h，所用有机溶剂是乙醇、丙酮或氯仿/甲醇混合溶液之一种或两种以上。

所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，步骤(1)中，间歇搅拌是指每间隔1h，搅拌5～10分钟。