[发明专利]一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法

权利要求书

1.一种从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)脱脂：将新鲜兔耳剥皮、去肉后得兔耳软骨，有机溶剂浸泡，取出软骨干燥后粉碎，得脱脂软骨粉；

(2)酶解：脱脂软骨粉用Tris-HCl缓冲液浸泡，煮沸后降温至37℃，加入胰蛋白酶，37℃恒温搅拌酶解后煮沸使酶灭活；

(3)乙醇沉淀：将(2)所得酶解液离心，上清液加入乙醇沉淀，离心后取沉淀加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得软骨素粗提产物；

(4)纯化：将(3)所得软骨素粗提产物用蒸馏水溶解，以蒸馏水和不同浓度氯化钠水溶液为流动相，经过Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有硫酸软骨素A组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到硫酸软骨素A。

2.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，该方法获得硫酸软骨素A的分子量为16～59kDa。

3.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入兔耳软骨的10～20倍体积有机溶剂，采用浸泡脱脂2～8h和/或采用有机溶剂浸泡和间歇搅拌配合脱脂2～8h，所用有机溶剂是乙醇、丙酮或氯仿/甲醇混合溶液之一种或两种以上。

4.根据权利要求3所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(1)中，间歇搅拌是指每间隔1h，搅拌5～10分钟。

5.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(2)中，酶解所用Tris-HCl缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，pH为7～9，胰蛋白酶的用量为脱脂软骨粉质量的1～10%。

6.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(3)中，乙醇沉淀时加入乙醇的体积为提取液体积的1～5倍，透析所用透析袋截留分子量为1000～10000Da。

7.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(4)中，Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换树脂纯化所用氯化钠水溶液浓度为0.7～1.0mol/L。

8.根据权利要求1所述的从兔耳软骨中制备高纯度硫酸软骨素A的方法，其特征在于，步骤(4)中，粗提产物用蒸馏水溶解后，经过Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换树脂分离纯化，用0.7～1.0mol/L的氯化钠水溶液先后洗脱2～8个柱体积，并收集洗脱液，经浓缩透析脱盐后，冷冻干燥，得到硫酸软骨素A。