[发明专利]双核酸标记的比率电化学免疫传感器

说明书

一、技术领域

本发明为一种基于双核酸标记的比率电化学免疫传感器。用两种分别标记电化学活性分子的核酸链构建双电化学信号免疫传感界面，其中1条链(捕获探针)在电极上以Au-S键固定，另1条链标记抗体，并通过碱基互补配对与捕获探针结合，在免疫反应诱导的邻位效应作用下离开传感器表面，使两种电活性分子分别远离和靠近电极表面，通过检测两种电活性分子的氧化电流之比，实现对目标蛋白质的简单、快速、高灵敏测定。

二、背景技术

免疫分析作为一种高选择性和高灵敏度的分析方法，在环境监测、临床诊断、食品安全等领域得到了日益广泛的应用。在实际应用中，要求发展简单、快速、灵敏的免疫检测方法。

根据免疫分析步骤的不同可分为异相免疫分析和均相免疫分析，后者因为能获得更高的灵敏度且免清洗易于实现自动化而被广泛应用于临床检测。与基于放射分析、荧光、化学发光、电化学发光、表面等离子共振等分析技术的免疫分析方法和传统的酶联免疫分析方法相比，电化学免疫分析具有仪器便宜、操作简便、灵敏度高等独特优点。各种电化学免疫传感器，尤其是安培免疫传感器得到广泛的研究和应用。在传统的电化学免疫方法中，大多使用异相免疫分析，需要多步清洗，耗时且样品容易污染。基于邻位效应发展的免疫分析方法近年来得到发展。在该方法中两种核酸-抗体偶联物与抗原(待测物)进行夹心免疫反应，使得在核酸-抗体偶联物上的两种不同核酸距离靠近，诱发邻位效应；这两种核酸的杂交或者连接产生新的检测核酸，通过检测产生的核酸，间接测定目标蛋白质的浓度。由于该方法可均相进行，具有简单、灵敏度高、特异性好、样品消耗少等优点。然而，该方法基本采用PCR技术来检测产生的检测核酸，步骤复杂，所需时间长。将电化学检测与邻位免疫分析方法结合起来，可以缩短检测时间，降低分析成本。

传统的电化学免疫分析方法都采用单信号检测，检测信号易受环境影响。本发明采用双电化学信号之比进行电化学免疫分析，可提高检测灵敏度和准确性，扩大线性范围，简化检测步骤。

三、发明内容

本发明的内容是：用两种电化学活性分子标记的核酸链构建比率电化学免疫传感界面，通过免疫反应诱导邻位效应，使1种电化学活性分子标记的核酸链离开电极表面，另1种电化学活性分子标记的核酸发生结构变化而使该电化学活性分子接近电极表面，导致它们的氧化信号减少或增加，通过两种电化学活性分子的氧化电流之比进行比率电化学免疫传感。

本发明通过以下技术方案来实现：

通过在金电极表面自组装两端分别标记巯基(SH)与二茂铁(Fc)的捕获探针DNA3，同时基于DNA3与DNA1间的互补杂交，使亚甲基蓝(MB)标记的DNA1-抗体1固定于电极表面，形成比率电化学免疫传感界面。在目标蛋白质存在时，DNA2-抗体2与DNA1-抗体1通过夹心免疫反应形成免疫复合物，并产生邻位效应，该效应促使DNA2与DNA1杂交，导致MB标记的DNA1-抗体1脱离免疫传感界面，同时，DNA3在金电极表面形成发夹结构，使Fc靠近电极表面。通过检测MB和Fc的氧化电流，用Fc和MB氧化电流的比值进行目标蛋白质的浓度测定。

上述捕获探针DNA3从3’端开始的1-4碱基与从5’端开始的1-4碱基完全互补，可形成发卡结构(图2)。

上述DNA1与DNA3及DNA2分别有12及11个碱基完全互补(图3，图4)。

本检测系统测定目标蛋白质的原理：

本发明设计的比率电化学免疫传感器的检测原理如图1所示：将含有目标蛋白质的样品溶液和DNA2-抗体2混合，并将微量混合液滴在比率电化学免疫传感界面，在室温条件下温育40分钟。温育过程中，目标蛋白质与抗体1、抗体2进行夹心免疫反应，并产生邻位效应，促使DNA2取代DNA3与DNA1杂交，导致电化学活性分子MB标记的DNA1-抗体1脱离免疫传感界面，同时DNA3在金电极表面形成发夹结构，使电化学活性分子Fc靠近电极表面。温育完成后，传感器用冲洗液冲洗，然后插入检测溶液，用交流伏安法检测Fc和MB的氧化电流；Fc及MB的氧化电流与目标蛋白质的浓度分别成正及负相关。用Fc与MB氧化电流的比值对目标蛋白质浓度的对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线测得待测溶液中目标蛋白质的浓度。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

本发明通过核酸链构建比率电化学免疫传感界面，结合免疫反应诱导的邻位效应、核酸的结构变化和电化学活性分子在电极表面的氧化电流相应，构建一种简单、快速、高灵敏的比率电化学免疫传感器。相对现有免疫分析方法，具有以下特点：