[发明专利]中国叶螨属常见种的PCR-RFLP鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及中国叶螨属常见种的PCR-RFLP鉴定方法。

背景技术

叶螨是蜱螨亚纲（Acari）、真螨总目（Acariformes）、绒螨目（Trombidiformes）、前气门亚目（Prostigmata）、异气门总股（Eleutherengonides）、叶螨科（Tetranychidae）的植食性螨类。叶螨是一种危害果蔬和温室植物的世界范围的重要经济害虫。叶螨属(Tetranychus)是叶螨科中经济意义最大的一类叶螨。该属叶螨与农业生产的关系密切，爆发严重时常导致作物干枯落叶，生长停滞，严重影响产量和质量，在经济上造成一定的损失。虽然叶螨属叶螨经济意义重大，但是由于形态学特征有限，且这些特征在不同种之间具有高度的相似性，再者同一植株或者同一叶片上叶螨常常会混合发生，使得叶螨的快速准确鉴定存在较大的困难。

目前，对于常规形态学鉴定较难分辨的物种，通常是采取PCR扩增特定片段如COI、ITS等然后直接测序，通过与数据库中已知序列对比鉴定物种。然而，此方法存在如下缺陷：1.数据库中的已知序列来源广泛，提交序列时数据库无法鉴别序列所属叶螨鉴定的正确性，如已有分析数据表明，数据库GenBank中的叶螨分子序列大约30%存在鉴定错误；2.PCR扩增后的ITS片段，需要经过纯化、克隆、挑斑等步骤，成本较高，若待鉴定叶螨数量较大，则载体、测序等成本非常高；3.克隆测序整个过程通常需要三天以上，若待鉴定叶螨数量较大，则工作量巨大，所耗时间更长。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种能区分中国叶螨属常见种的PCR-RFLP鉴别方法，从而在分子水平上迅速高效准确的鉴定叶螨物种。

一种中国叶螨属常见种的PCR-RFLP鉴定方法，包含以下步骤：

1）提取待鉴定叶螨总DNA；

2）使用叶螨中扩增ITS的通用引物PCR扩增ITS序列；

3）将上述PCR产物作为酶切模板,分别使用Rsa I、Mbo II、HpyF3I、Hinf I4种酶进行酶切反应，取酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察并拍照记录结果；

4）将待鉴定图谱与标准酶切图谱比对，通过比较酶切条带的数量与位置从而确定待鉴定叶螨的物种。

其中，所述的叶螨中扩增ITS的通用引物选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

所述PCR的反应体系如下：

所述PCR的扩增条件：预变性：95℃，4min；35个循环：变性95℃，30s，退火49℃，30s，延伸72℃，90s；最后再以72℃延伸10min。

所述的PCR扩增后，取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后在凝胶成像系统下观察并确认是否成功扩增出目的片段，目的片段作为下一步酶切反应的酶切模版。

所述的标准酶切图谱是使用通过形态学进行分类鉴定或经测序分类鉴定的常见种叶螨分别按照步骤1）～3）建立的电泳图谱。

所述的常见种叶螨包括二斑叶螨绿色型、二斑叶螨红色型、截形叶螨、神泽叶螨、卢氏叶螨、豆叶螨、马来西亚叶螨和皮氏叶螨。

有益效果

1、这种中国叶螨属常见种的PCR-RFLP鉴别方法与传统的形态学鉴定相比，克服了叶螨种间相似的形态学特征的干扰，且不受待鉴定个体性别与发育阶段的限制，从而进行快速准确的鉴定。

2、降低了鉴定的技术门槛，鉴定者无需分类学专业知识，只要掌握基本的PCR实验技术即可使用此鉴定方法，对比标准图谱很容易区分鉴定常见叶螨物种。

3、基于分子技术进行物种鉴定，比传统制作玻片观察形态学特征更具有高通量特性。

4、相比于PCR测序鉴定叶螨，此方法经济高效，通常半天即可完成全部鉴定，得到准确鉴定结果。内切酶也比常规克隆、测序试剂便宜很多。

5、本方法在横向比较国内常见叶螨种大量ITS序列后，分析种间稳定差异的变异位点，最终选择了Rsa I、Mbo II、HpyF3I、Hinf I四种内切酶的组合。它们的酶切位点在叶螨ITS序列中具有种内稳定性和种间差异性，从而保证了鉴定结果的准确可靠。

附图说明

图1叶螨属常见种的PCR-RFLP标准酶切图谱