[发明专利]一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉酶突变体及其制备方法，特别是一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法。

背景技术

α-淀粉酶，系统名称为α-1,4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶。α-淀粉酶的特点是在淀粉分子链中间将α-1,4糖苷键切断，不能水解α-1,6糖苷键，也不能水解紧靠1,6分支的α-1,4糖苷键，水解产物为可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。α-淀粉酶具有相当大的工业应用价值，广泛用于酒精、有机酸、氨基酸及纺织等行业。热稳定淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选、诱变和酶分子改造获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。诱变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。酶分子改造目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，达到热稳定性提高的目的。

发明内容

本发明提供了一种热稳定性淀粉酶突变体，是淀粉酶N端区域与短肽通过PT-linker连接得到的突变体；短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述PT-linker序列如SEQIDNO.3所示。

本发明还提供了一种制备所述淀粉酶突变体的方法，其技术方案如下：

1)据短肽和PT-linker序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pUC57中，构建重组质粒pUC57-P；

2)根据淀粉酶基因序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pET-20b(+)-Amy；

3)针对已分析序列设计引物，将重组质粒pUC57-P中的短肽和PT-linker序列克隆到重组质粒pET-20b(+)-Amy中，构建含有短肽、PT-linker和淀粉酶片段的重组质粒pET-20b(+)-AmyP，将短肽融合到淀粉酶的N端，获得含有突变淀粉酶序列与短肽序列融合状态的重组载体；

4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，获得突变体。

所述短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述PT-linker氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

所述淀粉酶突变体在降解、催化淀粉性基质中的应用也属于本发明要求保护的范围。

本发明提供的淀粉酶突变体的热稳定性好，在此改造条件下，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶在95℃的半衰期由对照(突变前)例的4h提高到7h。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该热稳定性提高的淀粉酶突变体应用于淀粉液化等领域，可以在高温下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pET-20b(+)-AmyP质粒图谱

具体实施方式

实施例1：淀粉酶热稳定性提高突变分析和方法

通过对淀粉酶3D空间结构进行分析，确定区域A(催化区域)、区域B、区域C。根据淀粉酶的氨基酸序列及结构相关性，选用短肽与淀粉酶序列进行融合表达，提高其热稳定性。

据短肽和PT-linker序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pUC57中，构建重组质粒pUC57-P。同时根据嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pET-20b(+)-Amy。针对已分析序列设计引物，将重组质粒pUC57-P中的短肽和PT-linker序列克隆到重组质粒pET-20b(+)-Amy中，获得含有突变淀粉酶序列与短肽序列融合状态的重组载体pET-20b(+)-AmyP（图1）。突变后重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，获得突变体。短肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；淀粉酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；PT-linker氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

实施例2：淀粉酶活力测定方法

DNS法测定淀粉酶酶活：

1)DNS试剂的配制：称取6.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1L容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液262mL，再加入185g酒石酸钾钠及5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，定容至1L，储存至棕色瓶中，放置于4℃冰箱待用。