[发明专利]检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试纸条。 

背景技术

自2002年以来，全球(荷兰、意大利、加拿大、美国以及英国等国家)报道的人感染H7亚型禽流感病毒(AIV H7)病例高达247人。根据中国疾控中心数据统计，2013年3月31日至2013年8月15日，中国上海、北京、江苏、浙江、安徽、福建江西、山东、河南、湖南等10个省份共报道了134例H7N9亚型禽流感病毒（AIVs）人感染病例，台湾确诊病例1人，其中45人死亡。H7亚型禽流感病毒不仅影响养禽业的健康发展，并且严重威胁人类的生命健康。为了有效地控制H7亚型禽流感病毒的传播，各国学者正致力于研发各种检测H7亚型禽流感病毒的方法。 

目前检测AIV的主要方法有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附(ELISA)、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、环介导等温扩增(LAMP)以及GeXP方法等。胶体金免疫层析分析(gold-immunochromatography assay，GICA)是近年发展起来的一种以胶体金为标记物，通过抗原抗体免疫学反应对样本中的生物大分子进行定性分析的免疫学分析技术。胶体金作为免疫标记物应用于免疫学分析始于1971年，随着1989首次以胶体金为标记物开发的艾滋病抗体渗滤检测试剂诞生以来，免疫胶体金快速检测技术在生命医学诊断各个领域中得到了广泛应用。目前尚未有H7亚型禽流感病毒快速检测的免疫胶体金试纸条的报道。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测H7亚型禽流感病毒胶体金免疫层析试纸条。 

本发明提供的试纸条，包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有金标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫； 

所述金标抗体为胶体金标记H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。 

上述试纸条中， 

所述胶体金的粒径为15-25nm。 

上述试纸条中， 

所述检测线T由H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体形成； 

所述质控线C由鼠源抗lgG抗体形成。 

上述试纸条中， 

所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG； 

上述H7亚型禽流感病毒的多克隆抗体具体为H7N2亚型禽流感病毒的多克隆抗体。 

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试纸条的方法。 

本发明提供的方法，包括如下步骤： 

1）先将胶体金溶液和H7亚型禽流感病毒单克隆抗体混匀，反应，收集固体反应物，再将所述固体反应物经BSA封闭，即得到金标抗体； 

在所述步骤1）的所述封闭后，还包括如下步骤：将所述封闭的产物收集沉淀，再溶解，得到金标抗体。 

上述封闭采用的缓冲液为含有质量百分含量为1%的BSA的20mmol/L硼酸钠水溶液； 

所述溶解采用的缓冲液为含有1%BSA和0.1%叠氮钠的20mmol/L的硼酸钠水溶液。 

2）制备灌注有金标抗体的偶联垫和含有检测线T和质控线C的NC膜； 

所述灌注有金标抗体的偶联垫为将所述金标抗体灌注到玻璃纤维棉上、干燥，即得到偶联垫；上述干燥为真空冻干；用于灌注金标抗体的玻璃纤维棉为将玻璃纤维棉放入含5%BSA，2%蔗糖，0.8%NaCl和0.05%NaN₃的PBS处理液中20min，37℃恒温烘干，得到。 

所述含有检测线T和质控线C的NC膜为将H7亚型禽流感病毒多克隆抗体和鼠源抗lgG抗体分别点射于NC膜上，形成含有检测线T和质控线C的NC膜； 

3）将所述NC膜、样品垫、所述偶联垫和吸水垫组装到支持板，得到胶体金免疫层析试纸条。 

上述方法中， 

步骤1）中，所述胶体金溶液和所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的加料体积比为200：1； 

所述H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的浓度为1mg/mL； 

所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为15-25nm； 

所述反应为25℃搅拌30min； 

所述胶体金溶液的pH值为9.0； 

步骤2）中，所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG。 

上述方法中， 

所述胶体金溶液按照如下方法制备：四氯金酸水溶液和柠檬酸钠水溶液混匀，反应，得到胶体金溶液；所述柠檬酸钠和所述四氯金酸的质量比为5:1； 

所述四氯金酸水溶液的反应温度为97℃；