[发明专利]一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，以及该制得的胎盘造血干细胞的保存方法。

背景技术

最新研究表明，胎盘中含有大量造血干细胞，同脐带血中的造血干细胞一样，

胎盘造血干细胞是高度未分化细胞，也可以说它是一切血细胞（其中大多数是免疫细胞）的原始细胞，可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症、淋巴瘤等）、血红蛋白病、骨髓造血功能衰竭（如再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患等多种疾病。

胎盘中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的10倍，足可供小孩自用几次或1～2个成人患者使用1一次，有效解决了移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植。 

目前，从胎盘中提取造血干细胞的流程为：（1）先将整个胎盘或胎盘绒毛膜组织用机械法分解成小块；（2）然后采用一种或几种酶进行消化，消化后过滤；（3）最后采用羟乙基淀粉(HES)法或淋巴分离液法回收含有造血干细胞的单个核细胞，有些还会在离心分离后采取免疫磁珠、流式细胞等方法，富集造血干细胞。现有技术存在以下缺陷：（1）分离得到的胎盘造血干细胞含量较低，如专利“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法” 中提取的单核细胞数为2～4×10⁹，其中CD34阳性的造血干细胞含量仅为0.3～0.7%，则CD34阳性的造血干细胞数最多为2.8×10⁷；（2）整个胎盘或胎盘绒毛膜组织体积都比较大，因此处理量大，不仅要用很大量的消化酶，增加了成本，而且还耗费时间，不利于细胞活性的保持。

另外，目前胎盘造血干细胞冻存液中大都添加血清或白蛋白等生物源性成份来保证冻存复苏后干细胞的生长需要/保持干细胞的高存活率。但目前还没有适合临床应用的血清，血清含有大量未知成分，质量不易控制，用于异体输注存在安全隐患，比如血清含有不能治愈的病毒或病原体，接受干细胞治疗的病人便会因而染病，后果十分严重。而合适浓度的白蛋白虽然在一定时间内也能保持细胞的高存活率，但目前所使用的白蛋白都是人源性或动物源性，存在安全隐患，不适合临床应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，该方法不仅能够提高所制备的胎盘造血干细胞的数量、活力以及CD34阳性细胞的含量，而且是临床应用级的，无潜在病原体污染，另外，该方法制备成本低。

本发明所采用的技术方案为：

一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜娩出胎盘立即进行预处理，然后分离出脐动脉和脐静脉；

（2）用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；

（3）用酶消化液灌注胎盘绒毛血管，置37℃温度下消化5～20min；

（4）用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体，该液体中包含了步骤（3）中消化后的酶消化液、灌注后的收集液；

（5）将步骤（2）、（4）得到的液体离心，弃上清后重悬细胞；

（6）重悬的细胞悬液经羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离，得到本发明临床应用级胎盘造血干细胞。

本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领域公知常识，即对胎盘进行消毒、除去胎盘包膜以及洗涤的步骤，在这里便不再详述。但是为争取时间，以尽量保持造血干细胞的活力，本发明对新鲜娩出的胎盘需立即进行这些预处理过程。

所述步骤（2）中清洗液为抗生素含量100～1000mg/L的溶液，其中所述抗生素为青霉素、链霉素、头孢氨苄、卡那霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素中的一种单独使用或几种联合使用，配制抗生素的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液或本领域其它常规培养液；优选为含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液，其中抗生素的浓度为100～300mg/L，青霉素、链霉素的加入比例为1：1。

上述清洗液的使用量为150～400ml。