[发明专利]一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法

权利要求书

1.一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）对新鲜娩出胎盘立即进行预处理，然后分离出脐动脉和脐静脉；

（2）用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；

（3）用酶消化液灌注胎盘绒毛血管，置37℃温度下消化5～20min；

（4）用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体；

（5）将步骤（2）、（4）得到的液体离心，弃上清后重悬细胞；

（6）重悬的细胞悬液经羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离，得到本发明临床应用级胎盘造血干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中清洗液为抗生素含量100～1000mg/L的溶液，所述抗生素为青霉素、链霉素、头孢氨苄、卡那霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素中的一种单独使用或几种联合使用，配制抗生素的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述清洗液的使用量为150～400ml。

3.根据权利要求2所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中清洗液为含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液，抗生素的浓度为100～300mg/L，其中青霉素、链霉素的加入比例为1：1。

4.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为含有0.03%~0.3%消化酶的溶液，所述消化酶为Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶、胰蛋白酶中的一种单独使用或几种联合使用，配制消化酶的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述酶消化液的使用量为150～200ml。

5.根据权利要求4所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为0.08%～0.22% I型胶原酶和0.08%～0.22% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液，使用该酶消化液时消化时间为8～15min。

6.根据权利要求5所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为0.1% I型胶原酶和0.1% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液，使用该酶消化液时消化时间为12min。

7.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液在使用前先经过解冻，且预热至37℃。

8.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中收集液为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述收集液的使用量为150～400ml。

9.根据权利要求8所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中收集液为DMEM培养液。

10.权利要求1所述的临床应用级胎盘造血干细胞的保存方法，其特征在于：在制备得到的临床应用级胎盘造血干细胞中加入冻存液，所述冻存液为含10%DMSO、5%人重组白蛋白的DEME溶液，所述冻存液的加入量为20～40%，然后冻存于-196℃。