[发明专利]百合未受精子房离体培养的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物单倍体培养技术领域，具体涉及通过百合未受精子房培养获得单倍体等新材料的一种组织培养方法。 

背景技术

百合（Lilium）是重要的观赏和食用植物。现代观赏百合大部分为远缘杂交的后代，等位基因杂合，遗传背景复杂，使得许多重要性状如花色、抗病虫性等遗传异常复杂。因而，在常规杂交育种中，对重要育种目标性状的遗传缺乏可预测性，加之生育周期长达3年以上，难以高效定向的优化聚合优良遗传基因。而利用单倍体培养技术可以在短时间内获得等位基因纯和的个体，这样就大大简化了遗传背景，利于进行重要性状的遗传分析，以便于在杂交育种中提高目标性状遗传的可预测性，有目的性地进行杂交育种工作，缩短育种年限，对提高新品种选育效率具有重要作用。同时，隐性性状得以表达，丰富了育种资源。获得的单倍体还可应用于基因转化、诱变、突变体筛选等研究中，为种质资源创新提供了一种快捷有效的新途径。此外，获得的单倍体经过加倍所建立的双单倍体群体也是进行分子标记、遗传图谱构建、基因定位等研究的理想材料。因此，对百合单倍体培养技术进行研究，对加快百合的遗传学基础研究、提高百合的育种效率和育种水平具有重要意义。 

未受精子房或胚珠离体培养是人工诱导雌核发育形成单倍体和双单倍体的技术之一。此技术尤其适用于雄性不育的植物，以及通过雄核发育难以获得单倍体的植物。来源于雌配子的单倍体最早在曼陀罗（Datura stramonium）中被发现（Blakeslee AF,Belling J,Farnham ME and Bergner AD.A haploid mutant in the Jimson weed,‘Datura stramonium’.Science,1922,55:646-647.）。这种自发的单倍体随后在其它植物（烟草、水稻、玉米、大麦和芸薹属作物）中也被发现，但是自发频率很低（Palmer CE and Keller WA.Overview of haploid.In:Biotechnology in agriculture and forestry,Vol.56.Nagata T,Lorz H and Widtholm JM(eds).Springer,Berlin Heidelberg,2005,pp3-10.）。因此，各国的研究学者对体外诱导雌核单倍体植株产生的方法进行了研究，于1976年首次利用大麦未授粉子房培养出单倍体植株（San Noeum LH.Haploides d’hordeum vulgare L.par culture in vitro non fecondes.Ann Amelior Plant,1976,26:751-754.）。之后未授粉子房或胚珠离体培养相继在约30个物种（如：大麦、小麦、水稻、玉米、洋葱、黄瓜、南瓜、甜菜、向日葵等）上获得了成功（Bohanec B.Doubled haploids in gynogenesis.In:Advances in Haploid Production in Higher Plants.Touraev A,Forster BP and  Moha S(eds).Springer,United Kingdom,2009,pp35-46.）。目前，这项技术已在洋葱和甜菜的育种中得以应用。而在百合中，未授粉子房或胚珠离体培养的研究相对甚少。谷祝平和郑国锠（1983）在‘大卫百合’中以1.2～1.8cm长的花蕾为试材进行未授粉子房离体培养主要通过愈伤途径获得了单倍体植株，MS培养基的愈伤诱导率高于N6培养基，当2,4-D和6-BA均为4mg·L^-1时，MS愈伤诱导率最高为47.76%。Prakash和Giles（Prakash J and Giles KL.Production of doubled haploids in oriental lilies.In:Genetic Manipulation in Plant Breeding.De Gruyter W and Co(eds).Berlin-New York,1986,pp335-337.）以1/2MS培养基为基础培养基并以2.0cm长的花蕾为试材利用子房切片培养在东方百合‘Leraza’中通过胚胎途径获得了少量雌核再生植株。Ramsay等（Ramsay JL,Galitz DS and Lee CW.Basal medium and sucrose concentration influence regeneration of Easter Lily in ovary culture.HortScience,2003,38:404-409.）以3～5cm花蕾长的铁炮百合‘Ace’为试材，采用切片培养通过愈伤途径获得了再生植株，此研究还表明MS培养基愈伤诱导率高于B5培养基，培养基中适合的蔗糖浓度是5%。赵珺（赵珺.百合未授粉子房离体培养及胚胎学研究.沈阳农业大学硕士论文，2007.）以OT品种‘黄巨人’的单核小孢子发育时期对应的子房为试材，采用MS诱导培养基通过愈伤途径获得了较低频率的单倍体（5.26%）和非整倍体（7.89%）。上述研究结果表明，到目前为止百合未授粉子房离体培养仅在少数几个基因型中获得成功，尤其是缺乏性状优良基因型培养成功的报道；大多数是采用MS培养基作为诱导培养基；在试验中三种基因型所选用的花蕾长度不一致；大多数是通过愈伤途径获得再生植株，其中单倍体频率低。此外，通过愈伤途径获得的二倍体再生植株，其有可能起源于体细胞，上述研究工作都缺乏对二倍体起源进行鉴定。