[发明专利]百合未受精子房离体培养的方法

权利要求书

1.百合未受精子房离体培养的方法，包括如下步骤：

（1）选取合适的花蕾，灭菌；

（2）取出子房，将其横切成片；

（3）将子房切片接种在含有诱导培养基的三角瓶或培养皿中培养20～25d，诱导胚珠内胚胎形成；

（4）将含有诱导膨大胚珠的子房片转接在植株再生培养基中，诱导胚胎萌发进行植株再生；

（5）将再生植株转接到生根培养中进行生根15～20d，获得根系健壮的无菌组培苗；

所述的合适花蕾为开花前1天的花蕾，

所述诱导培养基：BDS+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+蔗糖100g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；植株再生培养基为BDS+蔗糖50g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0；生根培养基为1/2MS++IBA0.1mg.L^-1+NAA0.1mg.L^-1+蔗糖60g.L^-1+琼脂6g.L^-1，pH6.0。

2.根据权利要求1所述的方法，所述诱导、生根的培养条件为：光照1600lx、14h白天/10h黑夜，（25±1）℃条件下进行培养。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤（4）的再生培养时间为80～100d。

4.根据权利要求1所述的方法，所述切片厚度为1～2mm。

5.根据权利要求1所述的方法，所述灭菌采取如下顺序步骤：将百合花蕾，置于无菌瓶中，先用75%的酒精表面灭菌30s，之后用10%NaClO消毒10min，然后无菌水冲洗3次，每次3分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括再生植株的倍性鉴定步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，所述倍性鉴定方法采用根尖染色体计数法：切取3～8mm根尖置于0.7mmol^-1放线菌酮中25℃预处理8～9h，然后放入卡诺氏固定液中固定24h，用蒸馏水洗净后，用1mol·L^-1HCl在60℃水浴条件下解离10min，蒸馏水漂洗2-3次，然后用卡宝品红染色制作压片，于显微镜下进行染色体观察，选取分散良好的中期分裂细胞进行显微拍照，每份材料观察30个处于有丝分裂中期的细胞，统计染色体数目，确定染色体倍性水平。

8.根据权利要求7所述的方法，所述显微镜的型号为Olympus CX31。