[发明专利]一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。

背景技术：

复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧保护缺血心肌，3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。

复方丹参滴丸中丹参味苦，性微寒，具有活血化瘀，养血安神，凉血排痈和排毒生肌的功效，是中药活血化瘀的常用药物。丹参药材主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸类成分，尚含有黄酮类、三萜类、甾醇等其他成分。二萜类成分中属醌、酮型结构的有丹参酮I、ⅡA、Ⅱ_R、V、Ⅵ，隐丹参酮，异丹参酮I、Ⅱ、II_B，二氢丹参酮I等。水溶性的酚酸类成分有丹参素，原儿茶醛，咖啡酸及丹参素与咖啡酸的衍生物或二聚物酯化而成的缩酚酸。

丹参素、原儿茶醛是复方丹参滴丸的主要成分，近年来，有关生物样品中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸的含量测定方法(如HPLC、LC-MS/MS等)有较多报道，但大多为上述化合物单独测定的方法。据文献报道，丹参素、原儿茶醛在人体会分别代谢生成间位丹参素和原儿茶酸。

中药药物代谢动力学是应用动力学原理，研究中药活性成分、组分、单味药和复方体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性的动态变化规律及其体内时-量、时-效关系，并用数学函数加以定量描述的一门新兴学科。开展中药药物代谢动力学研究对阐明和揭示中药药效物质基础和作用机制，设计及优选中药给药方案，促进中药新药研发、剂型改进及质量控制，均具有重要意义。目前中药药动学研究方法归纳起来可分为两大类，一类是针对成分明确的中药及复方，即血药浓度法；另一类是化学基础研究薄弱成分尚不明确的中药及复方，该类主要以生物效应法为研究手段，包括药理效应法、药物累积法、效量半衰期法、微生物法等。液相色谱质谱法是最近十几年来发展起来的一种新的分离分析方法，由于其高选择性和高灵敏度已成为药代动力学研究的一种较理想的检测方法。

为深入研究复方丹参滴丸主要成分在人体内的吸收及代谢过程，需要建立一种丹参素、原儿茶醛及其代谢产物同时测定的方法。

本发明经过研究找到一种丹参素、原儿茶醛、间位丹参素和原儿茶酸人血浆中联测的LC-MS/MS方法，本方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点，满足人体药代动力学要求。

发明内容：

人在服用含有丹参的药物，如复方丹参滴丸后，经过吸收和代谢，血浆中含有丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸。为检测服用复方丹参滴丸后人体血浆中上述成分的含量本发明提供了一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法，所述方法，包括以下步骤：

1）对照品储备液的制备

称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。

2）内标溶液的制备

取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。

3）血浆样品处理方法

取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。

4）含量测定

采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度。

优选的，所述方法，包括以下步骤：

1）对照品储备液的制备

分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，分别用甲醇配成浓度为150-250μg/ml的对照品储备液I。

分别取4种对照品储备液I，分别用40-60%（V/V）甲醇水溶液配制浓度均为2-6μg/ml的各自的对照品储备液II。

2）内标溶液的制备

称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250μg/ml的内标储备液，进一步用甲醇配制成3-7μg/ml的香草酸内标溶液。

3）血浆样品处理方法