[发明专利]一种测定人血浆中丹参素,间位甲基丹参素,原儿茶醛及原儿茶酸的方法有效
申请号: | 201410048909.4 | 申请日: | 2014-02-13 |
公开(公告)号: | CN104849379B | 公开(公告)日: | 2017-10-31 |
发明(设计)人: | 李伟;罗瑞芝;褚扬;杨柳;马晓慧;郭治昕;周水平;孙鹤 | 申请(专利权)人: | 天士力制药集团股份有限公司 |
主分类号: | G01N30/88 | 分类号: | G01N30/88 |
代理公司: | 北京华科联合专利事务所(普通合伙)11130 | 代理人: | 王为 |
地址: | 300410 天津市北辰区淮河*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 测定 血浆 丹参 间位 甲基 儿茶 方法 | ||
1.一种测定人血浆中丹参素,间位甲基丹参素,原儿茶醛及原儿茶酸的方法,其特征在于,所述方法,包括以下步骤:
1)对照品储备液的制备
称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品,用甲醇溶解,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液;
2)内标溶液的制备
取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液;
3)血浆样品处理方法
取血浆样品,加入内标溶液,甲醇,盐酸或三氯乙酸或高氯酸,乙酸乙酯,混合均匀后,离心取上清乙酸乙酯层,干燥,用甲醇复溶,离心,得血浆样品上清液;
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法,将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,
其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:
色谱柱:C18柱;预柱;菲罗门公司预柱,流动相:A相为0.1-0.5%的甲酸水溶液和B相为含0.1-0.5%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:
B相0-0.5min 1%~4%内平衡,
B相0.5-4.5min从1%~4%变成75%~95%,
B相4.51-5min从75%~95%变成95%,
B相5.01-6.5min从7 5%~95%变成1%~4%;
流速:0.2~0.5ml/min;
柱温:15~35℃;
进样器温度:2~10℃;
质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,
选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,
相关质谱参数如下:Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–3000~–5500V;
Temperature:400~700℃;
Curtain Gas:10.0~40.0;
Ion Source Gas1:40.0~80.0;
Ion Source Gas2:35.0~75.0。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)对照品储备液的制备
分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品,分别用甲醇配成浓度为150-250μg/ml的对照品储备液I,
分别取4种对照品储备液I,分别用40-60%(V/V)甲醇水溶液配制浓度均为2-6μg/ml的各自的对照品储备液II,
2)内标溶液的制备
称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250μg/ml的内标储备液,进一步用甲醇配制成3-7μg/ml的香草酸内标溶液,
3)血浆样品处理方法
取血浆样品150-250μl,依次加入内标溶液30-70μl,40-60%(V/V)甲醇水溶液30-70μl,0.5-2mol/L的盐酸溶液10-30μl,涡旋均匀,加入0.5-2ml乙酸乙酯,涡旋振荡20-40s,离心,取上清乙酸乙酯层500-1200μl,用氮气流吹干,用100-150μl40-60%(V/V)甲醇水溶液复溶,离心,得血浆样品上清液,
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法,将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,
其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:
色谱柱:C18柱;预柱;菲罗门公司预柱,流动相:A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:
B相0-0.5min 1%~4%平衡,
B相0.5-4.5min从1%~4%变成75%~95%,
B相4.51-5min从75%~95%变成95%,
B相5.01-6.5min从75%~95%变成1%~4%;
流速:0.2~0.5ml/min;
柱温:15~35℃;
进样器温度:2~10℃;
质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,
选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,
相关质谱参数如下:
Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–3000~–5500V;
Temperature:400~700℃;
Curtain Gas:10.0~40.0;
Ion Source Gas1:40.0~80.0;
Ion Source Gas2:35.0~75.0。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)对照品储备液的制备
分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各10.0mg分别置50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200μg/ml的对照品储备液I,
精密量取200μl各自对照品储备液I,分别用50%甲醇水溶液定容至10ml,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4μg/ml的各自的对照品储备液II,
2)内标溶液的制备
精密量取内标物香草酸10.0mg置50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得200μg/ml的内标储备液,精密量取此内标储备液125μl置于5ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得5μg/ml的内标溶液,
3)血浆样品处理方法
取血浆样品200μl,依次加入内标溶液50μl,50%甲醇水溶液50μl,1mol/L的盐酸溶液20μl,涡旋均匀,加入1ml乙酸乙酯,涡旋振荡30s,15000rpm离心1min,取上清乙酸乙酯层900μl,40℃下氮气流吹干,用120μl 50%甲醇水溶液复溶,15000rpm离心3min,得血浆样品上清液,
4)含量测定
采用LC-MS/MS色谱法,将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,
其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:
色谱柱:C18柱,50×2.1mm,5μm;
预柱:菲罗门公司预柱;
流动相:A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:
B相0-0.5min 2%,
B相0.5-4.5min 2%变成85%,
B相4.51-5min 85%变成95%,
B相5.01-6.5min95%变成2%;
流速:0.35ml/min;
柱温:25℃;
进样器温度:4℃,
质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,相关质谱参数如下:
Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–4200V;
Temperature:600℃;
Curtain Gas:20.0;
Ion Source Gas1:60.0;
Ion Source Gas2:55.0。
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