[发明专利]一种测定人血浆中丹参素,间位甲基丹参素,原儿茶醛及原儿茶酸的方法有效

专利信息
申请号: 201410048909.4 申请日: 2014-02-13
公开(公告)号: CN104849379B 公开(公告)日: 2017-10-31
发明(设计)人: 李伟;罗瑞芝;褚扬;杨柳;马晓慧;郭治昕;周水平;孙鹤 申请(专利权)人: 天士力制药集团股份有限公司
主分类号: G01N30/88 分类号: G01N30/88
代理公司: 北京华科联合专利事务所(普通合伙)11130 代理人: 王为
地址: 300410 天津市北辰区淮河*** 国省代码: 天津;12
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摘要:
搜索关键词: 一种 测定 血浆 丹参 间位 甲基 儿茶 方法
【权利要求书】:

1.一种测定人血浆中丹参素,间位甲基丹参素,原儿茶醛及原儿茶酸的方法,其特征在于,所述方法,包括以下步骤:

1)对照品储备液的制备

称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品,用甲醇溶解,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液;

2)内标溶液的制备

取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液;

3)血浆样品处理方法

取血浆样品,加入内标溶液,甲醇,盐酸或三氯乙酸或高氯酸,乙酸乙酯,混合均匀后,离心取上清乙酸乙酯层,干燥,用甲醇复溶,离心,得血浆样品上清液;

4)含量测定

采用LC-MS/MS色谱法,将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,

其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:

色谱柱:C18柱;预柱;菲罗门公司预柱,流动相:A相为0.1-0.5%的甲酸水溶液和B相为含0.1-0.5%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:

B相0-0.5min 1%~4%内平衡,

B相0.5-4.5min从1%~4%变成75%~95%,

B相4.51-5min从75%~95%变成95%,

B相5.01-6.5min从7 5%~95%变成1%~4%;

流速:0.2~0.5ml/min;

柱温:15~35℃;

进样器温度:2~10℃;

质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,

选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,

相关质谱参数如下:Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–3000~–5500V;

Temperature:400~700℃;

Curtain Gas:10.0~40.0;

Ion Source Gas1:40.0~80.0;

Ion Source Gas2:35.0~75.0。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)对照品储备液的制备

分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品,分别用甲醇配成浓度为150-250μg/ml的对照品储备液I,

分别取4种对照品储备液I,分别用40-60%(V/V)甲醇水溶液配制浓度均为2-6μg/ml的各自的对照品储备液II,

2)内标溶液的制备

称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250μg/ml的内标储备液,进一步用甲醇配制成3-7μg/ml的香草酸内标溶液,

3)血浆样品处理方法

取血浆样品150-250μl,依次加入内标溶液30-70μl,40-60%(V/V)甲醇水溶液30-70μl,0.5-2mol/L的盐酸溶液10-30μl,涡旋均匀,加入0.5-2ml乙酸乙酯,涡旋振荡20-40s,离心,取上清乙酸乙酯层500-1200μl,用氮气流吹干,用100-150μl40-60%(V/V)甲醇水溶液复溶,离心,得血浆样品上清液,

4)含量测定

采用LC-MS/MS色谱法,将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,

其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:

色谱柱:C18柱;预柱;菲罗门公司预柱,流动相:A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:

B相0-0.5min 1%~4%平衡,

B相0.5-4.5min从1%~4%变成75%~95%,

B相4.51-5min从75%~95%变成95%,

B相5.01-6.5min从75%~95%变成1%~4%;

流速:0.2~0.5ml/min;

柱温:15~35℃;

进样器温度:2~10℃;

质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,

选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,

相关质谱参数如下:

Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–3000~–5500V;

Temperature:400~700℃;

Curtain Gas:10.0~40.0;

Ion Source Gas1:40.0~80.0;

Ion Source Gas2:35.0~75.0。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)对照品储备液的制备

分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各10.0mg分别置50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200μg/ml的对照品储备液I,

精密量取200μl各自对照品储备液I,分别用50%甲醇水溶液定容至10ml,即得丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4μg/ml的各自的对照品储备液II,

2)内标溶液的制备

精密量取内标物香草酸10.0mg置50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得200μg/ml的内标储备液,精密量取此内标储备液125μl置于5ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得5μg/ml的内标溶液,

3)血浆样品处理方法

取血浆样品200μl,依次加入内标溶液50μl,50%甲醇水溶液50μl,1mol/L的盐酸溶液20μl,涡旋均匀,加入1ml乙酸乙酯,涡旋振荡30s,15000rpm离心1min,取上清乙酸乙酯层900μl,40℃下氮气流吹干,用120μl 50%甲醇水溶液复溶,15000rpm离心3min,得血浆样品上清液,

4)含量测定

采用LC-MS/MS色谱法,将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪,得到色谱图,根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在血浆中的浓度,

其中所述LC-MS/MS色谱法,色谱条件如下:

色谱柱:C18柱,50×2.1mm,5μm;

预柱:菲罗门公司预柱;

流动相:A相为0.1%的甲酸水溶液和B相为含0.1%甲酸的甲醇,进行梯度洗脱:

B相0-0.5min 2%,

B相0.5-4.5min 2%变成85%,

B相4.51-5min 85%变成95%,

B相5.01-6.5min95%变成2%;

流速:0.35ml/min;

柱温:25℃;

进样器温度:4℃,

质谱条件:采用ESI离子源,负离子模式,选择多反应监测模式MRM进行二级质谱分析,相关质谱参数如下:

Collision Gas:Medium;IonSpray Voltage:–4200V;

Temperature:600℃;

Curtain Gas:20.0;

Ion Source Gas1:60.0;

Ion Source Gas2:55.0。

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