[发明专利]一种从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药与化工领域，涉及肝素和硫酸皮肤素的制备方法，具体涉及从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法。 

背景技术

肝素钠(heparin sodium)是N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖，目前肝素钠生产主要是从猪的小肠粘膜中提取，它属粘多糖(GAG)类物质，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血管栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环和血液透析等。 

硫酸皮肤素(dermatan sulfate，DS或CSB)也是糖胺聚糖的一种，由N-乙酰氨基半乳糖-β-1,4-L-艾杜糖醛酸-α(或D-葡萄糖醛酸-β)-1，3的二糖重复单位构成的多糖。DS广泛分布于动物组织中，属于硫酸软骨素(CS)的一种，具有抗血栓、抗水肿、促进皮肤更新、阻止皮肤的过度角质化和棘皮症、滋润皮肤和保持水分的作用，可用于降血脂、骨关节疾病治疗以及滴药液。 

传统的硫酸皮肤素来源于动物皮层或牛肺中，特别是水生生物(如鮟鱇鱼等)的皮层，通过酶降解和酸碱沉淀的方式得到，最后再通过离子交换层析获得高纯度的硫酸皮肤素。目前较为成熟的提取方法是从鮟鱇鱼皮中进行提取，再通过醇沉冻干后即可得硫酸皮肤素粗品，该法得到的硫酸皮肤素粗品灰色粉末状，纯度为75％。 

2006年唐明龙等人(专利申请号：200610039006.5)以粗品肝素为原料，通过离子交换、高锰酸钾氧化、超滤和有机溶剂分级沉淀生产高纯度肝素钠原料药，该方法使用不同浓度的氯化钠溶液进行了多次洗脱，有效的分离了杂质，所得的肝素钠效价、光吸收等指标均达到国家药典要求。 

2009年李坦等人(专利申请号：200910039361.6)以肝素副产物为原料，通过酸碱沉淀，再以离子交换吸附，线性梯度洗脱，最后以浓缩醇沉后得到高纯度的硫酸皮肤素，其所得的硫酸皮肤素的HPLC测定纯度，旋光度及抗凝效价的检测均较为理想。 

目前国内的肝素生产以粗品肝素为主，其中含有大量的硫酸皮肤素，本发明提供的从猪小肠粘膜浸出液中一步纯化肝素和硫酸皮肤素的方法，不仅提高了产品的质量，得到了高纯度的肝素，并且充分利用了生产的副产物，得到了高纯度硫酸皮肤素，所得的肝素和硫酸皮肤素的纯度均较高，适合用于工业的大规模生产。 

发明内容

本发明的任务是提供一种从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法和一种从小肠浸出液中提取肝素的方法，以改进现有粗品肝素的生产工艺，提高肝素产品的纯度，以解决目前生产的粗品肝素中含有大量硫酸皮肤素杂质的问题，获得能用于生产注射级精品肝素以及药用级硫酸皮肤素。 

实现本发明的技术方案是： 

本发明提供的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，包括以下步骤： 

步骤一：称取新鲜猪小肠粘膜，在绞肉机中绞碎，加入重量为猪小肠粘膜重量0.25％的市售胰蛋白酶，37℃搅拌30分钟；加入重量为猪小肠粘膜重量3％的氯化钠一边搅拌一边加入30％的氢氧化钠溶液，直至pH达到9.0；于55℃保温继续以20rpm速度搅拌2～3小时；升温至95℃10分钟，迅速冷却到室温，即得猪小肠粘膜浸出液；将猪小肠粘膜浸出液用2层市售医用纱布过滤，除去大颗粒的不溶物，得澄清的无色液体；加入0.5-1.5倍体积的去离子水，使猪小肠粘膜浸出液总体积达到稀释1.5-2.5倍，即得到稀释后的猪小肠粘膜浸出液； 

步骤二：取已填充D254树脂或Amberlite树脂或Lewatit树脂的填充柱，将填充柱固定到常规的层析设备上，填充柱以去离子水清洗2个柱体积；利用蠕动泵以3mL/min的速度将稀释后的猪小肠粘膜浸出液加入D254树脂填充柱，加入稀释后猪小肠粘膜浸出液体积为柱体积的1.5～2.0倍；待猪小肠粘膜浸出液后全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱体积的pH8.5的Tris-HCl的缓冲液； 

步骤三：向填充柱加入1.1～1.3mol/L氯化钠溶液，进行第一次洗脱，洗脱流速为5mL/min，具体收集体积以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集的洗脱液标为洗脱液1；向填充柱加入2.0～2.3mol/L氯化钠溶液，进行第二次洗脱，洗脱流速为5mL/min；具体收集体积也以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集洗脱液标为洗脱液2； 

步骤四：先按以下(A)、(B)两种方法中的一种制取浓缩洗脱液1：