[发明专利]一种从小肠浸出液中提取肝素和硫酸皮肤素的方法

权利要求书

1.一种从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，包括以下步骤：

步骤一：称取新鲜猪小肠粘膜，在绞肉机中绞碎，加入重量为猪小肠粘膜重量0.25％的市售胰蛋白酶，37℃搅拌30分钟；加入重量为猪小肠粘膜重量3％的氯化钠一边搅拌一边加入30％的氢氧化钠溶液，直至pH达到9.0；于55℃保温继续以20rpm速度搅拌2～3小时；升温至95℃10分钟，迅速冷却到室温，即得猪小肠粘膜浸出液；将猪小肠粘膜浸出液用2层市售医用纱布过滤，除去大颗粒的不溶物，得澄清的无色液体；加入0.5-1.5倍体积的去离子水，使猪小肠粘膜浸出液总体积达到稀释1.5～2.5倍，即得到稀释后的猪小肠粘膜浸出液；

步骤二：取已填充D254树脂或Amberlite树脂或Lewatit树脂的填充柱，将填充柱固定到常规的层析设备上，填充柱以去离子水清洗2个柱体积；利用蠕动泵以3mL/min的速度将稀释后的猪小肠粘膜浸出液加入D254树脂填充柱，加入稀释后猪小肠粘膜浸出液体积为柱体积的1.5～2.0倍；待猪小肠粘膜浸出液后全部加到填充柱后，向填充柱加入2倍柱体积的pH8.5的Tris-HCl的缓冲液；

步骤三：向填充柱加入1.1～1.3mol/L氯化钠溶液，进行第一次洗脱，具体收集体积以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集的洗脱液标为洗脱液1；向填充柱加入2.0～2.3mol/L氯化钠溶液，进行第二次洗脱，具体收集体积也以298nm吸收峰值下降到洗脱前水平为准，将收集洗脱液标为洗脱液2；

步骤四：先按以下(A)、(B)两种方法中的一种制取浓缩洗脱液1：

(A)将步骤3获得的洗脱液1通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液1；

(B)采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液1进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液1；

再向所得浓缩洗脱液1中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心，去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为85～89％的硫酸皮肤素。

2.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤三中，洗脱流速为5mL/min。

3.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤四之方法(A)中，旋蒸温度为60℃。

4.根据权利要求1所述的从猪小肠浸出液中提取硫酸皮肤素的方法，其特征在于，在步骤四之方法(B)中，所述的采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液1进行超滤的具体方法是：采用密理博公司的Pellicom超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤。

5.一种从小肠浸出液中提取肝素的方法，其步骤是：

先将权利要求1之步骤三获得的洗脱液2，按照以下(a)、(b)两种方法中的一种制备浓缩洗脱液2：

(a)将步骤3获得的洗脱液2通过1000Da的透析膜，在去离子水中透析除盐，透析18～22h，体积增大45～55％；在55～65℃下旋蒸45min，得到浓缩洗脱液2；

(b)采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液2进行超滤，当体积减小到原体积的20～22％，得到浓缩洗脱液2；

再向所得浓缩洗脱液2中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40～50％，出现白色沉淀物，通过离心去除上清，将沉淀在60℃烘箱中放置过夜，获得纯度为95～98％的肝素。

6.根据权利要求5所述的从小肠浸出液中提取肝素的方法，其特征在于，在方法(a)中，旋蒸温度为60℃。

7.根据权利要求5所述的从小肠浸出液中提取肝素的方法，其特征在于：方法(b)中所述的采用切向流超滤方法对步骤3获得的洗脱液2进行超滤的具体方法是：采用密理博公司的Pellicom超滤系统，以1000Da的超滤膜进行超滤。