[发明专利]一种从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽药物的提取纯化方法，特别涉及一种从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法。

背景技术

人类松弛素-2，又名松弛肽，英文名为Relaxin，药物通用名为Serelaxin，是一种采用基因重组方法制备的多肽药物。其结构由两条肽链组成，A链含24个氨基酸且存在链内二硫键，B链含29个氨基酸，A链与B链通过两个二硫键相连，其结构式如下所示：

其中pGlu为焦谷氨酸，Tyr为酪氨酸，Ser为丝氨酸，Asn为天冬酰胺，Cys为半胱氨酸，His为组氨酸，Val为缬氨酸，Gly为甘氨酸，Thr为苏氨酸，Lys为赖氨酸，Arg为精氨酸，Leu为亮氨酸，Phe为苯丙氨酸，Asp为天冬氨酸，Trp为色氨酸，Met为蛋氨酸，Glu为谷氨酸，Ile为异亮氨酸，Ala为丙氨酸，Gln为谷酰胺。

近年研究发现，松弛肽对心力衰竭、先兆子痫等疾病具有显著的预防和治疗作用，能够显著缓解心力衰竭及其导致的呼吸困难症状。专利文献EP0707650 B1（优先权日1993年6月21日，公开日2003年5月21日）公开了一种采用基因重组技术制备人类松弛素-2的方法，其中从发酵液中提取纯化人类松弛素-2需要先后采用阳离子交换柱、C18硅胶柱、阳离子交换柱、Sephadex G-15进行4次提取纯化，工艺步骤复杂，耗时较长；专利文献CN102603888 B（申请日2012年4月11日，公开日2013年11月20日）公开了一种采用毕赤酵母菌制备人类松弛素-2的方法，其中从发酵液中提取纯化人类松弛素-2需要反复进行数次微孔滤膜过滤，且需要3次色谱柱分离纯化操作，耗时较长。以上工艺步骤提取纯化人类松弛素-2虽然能够提高产品收率及终产品中人类松弛素-2的纯度，但因工艺步骤复杂，耗时较长，无法满足大工业生产的需要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供更为高效的从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法，包括以下步骤：

1）取发酵液，5000～7000rmp离心10～60分钟，收集上清液；

2）步骤1）的上清液，加入4倍体积的70％丙酮，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液调pH为5.0，加入尿素，使溶液中尿素的浓度为5～15mol/L，2℃～8℃静置过夜； 

3）步骤2）的溶液，12000～16000rmp离心10～60分钟，过截流分子量3000的醋酸纤维素超滤膜，收集浓缩液；

4）步骤3）的浓缩液上SephadexG-50柱，柱长22厘米，洗脱溶剂为含0.15mol/L氯化钠的1mol/L乙酸，流速为15mL /小时，收集洗脱液，真空低温浓缩；

5）步骤4）的浓缩液上Synchropak RP-P C18反相HPLC层析柱，柱长50厘米，用含0.1%的三氟乙酸平衡和洗涤，用含50%乙腈的0.1% 三氟乙酸溶液洗脱25分钟，洗脱速度为90mL/小时，再用含80%乙腈的0.1% 三氟乙酸溶液洗脱30分钟，洗脱速度为90mL/小时，收集洗脱液；

6）步骤5）的洗脱液，低温旋蒸浓缩，冷冻干燥，得纯化的人类松弛素-2。

作为本发明的进一步优化，所述步骤1）离心速度为6000rmp，离心时间为15分钟。

作为本发明的进一步优化，所述步骤3）离心速度为14000rmp，离心时间为30分钟。

作为本发明的进一步优化，所述步骤4）中尿素的浓度为7mol/L。

本发明的从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法，不仅能够保证终产品人类松弛素-2的收率和纯度，同时可以简化工艺步骤，缩短提取纯化时间，工艺条件易控制，适于大规模工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的解释。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1  从发酵液中提取纯化人类松弛素-2

1）取发酵液，6000rmp离心15分钟，收集上清液；

2）在步骤1）的上清液中加入4倍体积的70％丙酮，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液调pH为5.0，加入尿素，使溶液中尿素的浓度为7mol/L，5℃静置过夜； 

3）将步骤2）的溶液14000rmp离心30分钟，过截流分子量3000的醋酸纤维素超滤膜，收集浓缩液；