[发明专利]高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重叠延伸PCR方法，具体的说是一种高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法。

背景技术

自1989年，重叠PCR技术（splicing by overlapping extension PCR，SOE-PCR）被Horton等首次应用于定向诱变和融合基因构建以来，该技术得到了广泛应用。重叠延伸PCR采用具有互补末端的引物，使PCR 产物形成了重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。重叠PCR不需要限制性内切酶消化和连接酶处理，同时由于中间无任何目的基因以外的其他序列，可避免因加入连接序列导致的表达蛋白的功能异常。具有简便、高效、快速，易于操作等优点。

但是我们在重叠延伸PCR构建融合基因的时候，发现针对某些高GC含量和复杂模板的片段有一定难度，如非特异性条带较多，易发生突变和电泳结果出现弥散带等缺点。同时常规重叠延伸PCR也都有PCR耗时较长、循环数偏多、及其过程中需要复杂的纯化步骤，操作比较繁琐等问题需要解决。

发明内容

本发明的目的是通过对重叠延伸PCR技术的改进，特别是针对某些高GC含量和复杂结构模板的片段的重叠延伸PCR过程中出现的，如非特异性条带较多、易发生突变和电泳结果出现弥散带等问题，建立一种更有效的构建融合基因的方法。

高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其具体制备步骤包括：

1、两个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；

步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

2、三个DNA小片段的连接，其具体步骤包括：

步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；

步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A；

    步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。

本发明高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，还可以用于三个以上小片段的连接。

有益效果是：本发明改进的重叠延伸PCR方法，针对高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增，提供了有效的扩增手段；高GC含量或复杂结构模板的DNA片段扩增的过程中，容易较多扩增弥散带、非特异性条带，并且易发生突变；而本发明所提供的方法各个DNA小片段的仅5-8个循环扩增即可作为模板，且第一轮PCR产物不必纯化，直接将PCR产物与外侧引物混合，DNA小片段的完整扩增和片段之间的连接同时进行，从而降低了PCR循环数，省略了纯化步骤，因而具有耗时短、循环数少、操作简单的特点，由于循环数少因而也提高了保真度高，因而降低了PCR的工作量，也节省了时间和试剂，通过降低PCR循环数来降低模板浓度以及优化中间引物重叠区长度，因而可以将PCR特别是高GC含量或复杂结构模板PCR扩增弥散带或非特异性条带的加以去除。另外，本发明也适用于改进的重叠延伸PCR方法进行定点突变。

附图说明