[发明专利]高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法在审
| 申请号： | 201410045588.2 | 申请日： | 2014-02-08 |
| 公开（公告）号： | CN103820430A | 公开（公告）日： | 2014-05-28 |
| 发明（设计）人： | 孟祥平;杨建英;梁高峰;景爱华;冯文坡;乔晓岚 | 申请（专利权）人： | 河南科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120 | 代理人： | 罗民健 |
| 地址： | 471000 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | gc 含量 复杂 结构 dna 模板 片段 重叠 延伸 pcr | ||
1.高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于：其具体步骤包括：
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，两个相邻DNA小片段的两对引物的末端设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；然后采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到两组PCR产物；
步骤二、分别取步骤一中所得的两组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第二轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使两个DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
2.如权利要求1所述的高GC含量或以复杂结构DNA为模板的DNA片段的重叠延伸PCR法，其特征在于：其具体步骤包括：
步骤一、根据所需融合的两个DNA小片段设计引物，相邻的两个DNA小片段的引物末端均设计一个重叠区段，长度为22-26bp，引物重叠区的Tm值与各引物与模板特异性结合部分的Tm值一致；采用所设计的引物，以所需融合的全长基因为模板，分别进行平行的PCR，PCR设置为5-8个循环，得到三组PCR产物；
步骤二、取步骤一所得的三组未纯化的PCR产物中，两个相邻DNA小片段所对应的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，进行PCR循环，PCR设置为5-8个循环，PCR结束后得到将所得PCR产物A；
步骤三，取步骤二中所得PCR产物A与步骤一所得的另一组未纯化的PCR产物进行等摩尔混合，将所得混合物作为模板，然后加入所需融合的全长基因的一对外侧引物，在DNA聚合酶的作用下进行第三轮PCR反应，通过DNA小片段重叠末端的延伸使各DNA小片段连接成所需融合的全长基因。
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