[发明专利]鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及AMP脱氨酶基因的真核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

AMP脱氨酶，英文名为AMP deaminase，简写为AMPD，是一种氨基水解酶，其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸（IMP）和NH3，IMP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。

AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”（申请人：天野酶株式会社）中报道过一次。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请人经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。

本发明的技术方案如下：

鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，是以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。

具体的，所述方法步骤如下：

（1）鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆

以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；

（2）重组表达载体的构建

将表达载体pKLAC1和步骤（1）所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；

（3）线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选

提取步骤（2）所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactis GG799，使用步骤（1）所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；

（4）重组酶在GG799中的表达

将步骤（3）筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2%的接种量接种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。

优选地，步骤（1）所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）MCCC No.1A01641。

本发明还提供了上述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。

本发明的有益技术效果在于：

本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组载体pKLAC1-AMPD的构建，转化，阳性克隆转化子和多拷贝转化子的筛选，液体发酵等步骤及其工艺条件参数的精心分析和优化，在乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis GG79）中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶。实验结果显示，本发明制备得到的重组AMP脱氨酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础，可应用于食品、医药等领域。

附图说明

图1为实施例2中重组表达载体pKLAC1-AMPD酶切验证电泳图。

图2为实施例4中Kluyveromyces lactis GG79重组菌不同发酵时间的酶活变化趋势图。

具体实施方式

以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。