[发明专利]鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法有效
| 申请号： | 201410040528.1 | 申请日： | 2014-01-28 |
| 公开（公告）号： | CN103757035A | 公开（公告）日： | 2014-04-30 |
| 发明（设计）人： | 张梁;石贵阳;方炜;丁重阳;顾正华 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/55 | 分类号： | C12N15/55;C12N15/81;C12N9/78 |
| 代理公司： | 无锡华源专利事务所(普通合伙) 32228 | 代理人： | 冯智文 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 鼠灰链 霉菌 amp 脱氨酶 基因 乳酸 克鲁 酵母 表达 方法 | ||
1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于：以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
2.根据权利要求1所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；
（2）重组表达载体的构建
将表达载体pKLAC1和步骤（1）所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；
（3）线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选
提取步骤（2）所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactis GG799，使用步骤（1）所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；
（4）重组酶在GG799中的表达
将步骤（3）筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2%的接种量接种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。
3.根据权利要求2所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于：步骤（1）所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus）MCCC No.1A01641。
4.权利要求1～3任一项所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
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