[发明专利]一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，尤其涉及适用于粳稻品种资源多样性评价及粳稻分子辅助育种中检测亲本遗传差异。

背景技术

水稻的遗传改良和突破性品种的选育均主要依赖于种质资源的掌握和利用。只有了解育种材料的遗传变异信息，才能有针对性地选择亲本，在后代中获得较大的杂种优势，从而培育出优良品种。因此，亲本遗传多样性的分析对于水稻新品种的选育具有重要意义。

近些年，由于水稻全基因组测序工作已经完成，在此基础上，对有利基因进行剪切、聚合和改良，进行设计育种以培育在产量、品质、抗逆性等多方面都具有强优势的水稻新品种已成为未来水稻育种必然趋势。其核心技术之一便是标记辅助选择和全基因组设计，而二者的重要基础就是育种亲本材料遗传差异的确定。此外，粳稻以其优于籼稻的优良食味获得了越来越多人的喜爱，但粳稻品种存在的遗传差异较小问题，使得选择差异较大粳稻作为亲本进而获得较大杂种优质变得越发困难。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法，用以克服上述技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，所述分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2

个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记。

进一步，上述分析标记获取时，采用亲缘关系较近的日本粳稻品种一目惚、丰锦、笸锦、日本晴、秋田小町；东北稻区导入少量籼稻血缘的沈农265、辽粳263、辽粳294；以及广亲和粳稻02428为材料。

进一步，所述分子标记以PIC值>0.50作为参考指标。

本发明还提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，该具体过程为：

步骤a，DNA提取；

步骤a1，取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；

步骤a2，加入预热至65℃的CTAB抽提液；

步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；

步骤a4,取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；

步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；

步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上;

步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；

步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；

步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增。

步骤b，PCR扩增;PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl₂，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA聚合酶;

步骤c，PCR产物检测;

在上述步骤b中的扩增产物中加入上样缓冲液，取5μL上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，接通电极，在80W的恒定功率下电泳2-3小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色，照相统计。

步骤d，统计分析；具体为：

步骤d1，对标记位点的多态性信息量(PIC值)进行计算；

步骤d2，遗传多样性分析，计算各材料间的遗传距离GD。

进一步，上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w／v)CTAB；100mmol／LTris-Hcl，pH8.0；20mmol／LEDTA，pH8.0；1.4mol／LNaCl]600μL。

进一步，上述步骤d2中，PIC值依据下述公式计算，

PIC=1-∑fi²

式中，fi表示i位点的基因频率。