[发明专利]一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法

权利要求书

1.一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，.其特征在于，所述分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记。

2.根据权利要求1所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，其特征在于，上述分析标记获取时，采用亲缘关系较近的日本粳稻品种一目惚、丰锦、笸锦、日本晴、秋田小町；东北稻区导入少量籼稻血缘的沈农265、辽粳263、辽粳294；以及广亲和粳稻02428为材料。

3.根据权利要求2所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，其特征在于，所述分子标记以PIC值>0.50作为参考指标。

4.一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，该具体过程为：

步骤a，DNA提取；

步骤a1，取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；

步骤a2,加入预热至65℃的CTAB抽提液；

步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；

步骤a4,取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；

步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；

步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上;

步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；

步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；

步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增;

步骤b，PCR扩增;PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl₂，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA聚合酶；

步骤c，PCR产物检测；

在上述步骤b中的扩增产物中加入上样缓冲液，取5μL上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，接通电极，在80W的恒定功率下电泳2-3小时，关闭电源;取下凝胶，银染显色，照相统计；

步骤d，统计分析；具体为：

步骤d1，对标记位点的多态性信息量(PIC值)进行计算；

步骤d2，遗传多样性分析，计算各材料间的遗传距离GD。

5.根据权利要求4所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w／v)CTAB;100mmol／LTris-Hcl，pH8.0;20mmol／LEDTA，pH8.0;1.4mol／LNaCl]600L。

6.根据权利要求4所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，上述步骤d2中，PIC值依据下述公式计算，

PIC=1-∑fi²

式中，fi表示i位点的基因频率。

7.根据权利要求6所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤d2中，对遗传多样性分析时，将扩增产物的每一条带视为一个位点，具有多态性的条带赋值为″1，无此带时赋值为″0″。

8.根据权利要求7所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤d2中，

各材料间的遗传距离GD按下式计算：

GD＝-ln2Nxy／(Nx+Ny)，

式中Nxy为材料x、y的公共条带数，Nx为材料x的条带数，Ny为材料y的条带数。