[发明专利]一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，属于昆虫病害防治领域。

背景技术

中华蜜蜂（Apis cerana cerana, 简称中蜂），是我国土生土长的蜂种。蜜蜂很容易受到各种病害的威胁，病原物包括有病毒、细菌、真菌和原生动物等。目前，在蜜蜂中已发现的病毒病至少有22种。其中，囊状幼虫病是危害较严重的一种病毒病。中华蜜蜂囊状幼虫病最早是1972年在广东省发现的，之后迅速蔓延全国。中华蜜蜂囊状幼虫病毒感染蜜蜂幼虫后，使其不能化蛹，大量的液体和病毒粒子聚集于病虫体内，且虫体颜色由珍珠白色逐渐变为浅黄色，在死亡之后，蜜蜂虫体会逐渐变得干枯，形成一个暗褐色如龙船状的鳞片，该病害对中华蜜蜂构成了严重的威胁，往往会造成蜂群、甚至整个蜂场的蜜蜂死亡。

目前，尚无治愈蜜蜂囊状病的方法和特效药物，主要以预防为主。主要通过选育抗病品种、适时换王、加强饲养管理和一些中草药来综合防治该病毒病。化学药物治疗造成蜂产品药物残留的食品安全问题，中草药治疗治标而不治本。RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。由于其特异性和有效性，已被认为是一种重要的特异性基因阻断技术，目前RNAi已成为疾病防治和药物筛选的重要研究手段。本发明利用中华蜜蜂囊状幼虫病毒自身复制基因合成双链RNA，采用RNA干扰方法来防治中华蜜蜂囊状幼虫病。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，本发明的双链RNA是用大肠杆菌诱导表达的，成本低，并且对中华蜜蜂囊状幼虫病的防治具有良好的治愈效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用RNA干扰技术防治中华蜜蜂囊状幼虫病的方法，其步骤包括以下：

（1）收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置-80℃冰箱保存；

（2）中华蜜蜂囊状幼虫病毒复制基因-RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增：采用Trizol法提取患病幼虫的总RNA，用RdRp基因的下游引物进行反转录合成cDNA，PCR扩增目的基因片段，将该基因片段连接到PMD18-T载体，挑取含有该基因片段的单菌落送至华大基因公司进行序列测定；

（3）dsRdRp原核表达载体的构建，将（2）中扩增的目的片段，在T4连接酶的作用下连接至L4440载体，16℃连接过夜；将T4酶连接产物转入HT115感受态细胞中，涂布于含有100 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上；

（4）dsRdRp的诱导表达：将（3）中阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₅₉₅ = 0.5-0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，即IPTG进行诱导，处理后37℃继续震荡培养4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp；

（5）dsRdRp的大量表达并添加懂到饲料中饲喂给蜜蜂幼虫。

所述的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；琼脂，15 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min；所述LB液体培养基配方为：胰蛋白胨，10 g；酵母提取物5 g；氯化钠，10 g；用去离子水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min。

本发明的优点在于：用RNA干扰方法对中华蜜蜂囊状幼虫病进行防治，该方法采用细菌原核表达dsRNA，成本低，且选用的基因片段RdRp是病毒复制的基因，沉默该基因的表达，抑制中华蜜蜂囊状幼虫病毒的复制，特异性强。

附图说明

图1 RNA依赖的RNA聚合酶基因PCR的扩增。

图2 dsRdRp的原核表达结果。

图3中华蜜蜂幼虫的化蛹率和羽化率。其中dsGFP为对照组；dsRdRp（0.5）为0.5 μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.2）为0.2 μg/ml的dsRdRp；dsRdRp（0.8）为0.8 μg/ml的dsRdRp。

具体实施方式

实施例1

收集患中华蜜蜂囊状幼虫病的幼虫或蛹放置-80℃冰箱保存。