[发明专利]一种重组猪防御素及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组猪防御素及其制备方法和用途。

背景技术

抗菌肽（Antibacterial Peptides，ABPs），又称抗微生物肽(AntimicrobialPeptides,AMPs)，广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽，是生物先天免疫防御系统的一个重要组成部分，在黏膜免疫系统中起重要作用，称之为“第一道防御体系”或“第一道免疫体系”。抗菌肽广泛存在于细菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物体内，不仅具有广谱抗细菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定杀抑作用。此外，还具有稳定、水溶性好、抗菌机理独特、无耐药性、对高等动物正常细胞无害等特点，从而显示了其在医学和农业上潜在的研究和应用价值。

猪防御素属于抗菌肽家族的一员，其抗菌活性好，但是猪体内天然防御素表达量低、分子小，分离困难，化学合成防御素成本高，所以利用分子生物学技术重组表达外源基因是获取目标蛋白的有效途径。

彭章华等，“猪防御素PBD-1基因的克隆及其表达载体构建”，遗传繁育，中国畜牧兽医，2005年第32卷第11期以及罗刚等，“猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达”，遗传2003年第2卷第25期中，均公开了构建猪防御素基因PBD-1重组表达载体的方法，但是均未表达得到有活性的重组猪防御素。

发明内容

本发明的目的是提供了一种有抑菌活性的重组猪防御素及其制备方法。

本发明重组猪防御素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种重组载体，它包括SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述的重组载体优选为重组毕赤酵母表达载体pPIC9。

本发明提供了一种重组菌，它包括前述的重组载体。所述重组菌优选为重组毕赤酵母。

本发明提供了前述重组菌的发酵方法，它是将前述重组菌在酵母菌培养基中培养，甲醇诱导表达，即可。

其中，前述发酵方法包括如下步骤：

（1）菌体生长：将重组菌置于BMGY培养基中，于25～35℃培养36～60h，离心收集菌体；

（2）诱导表达：再用BMMY诱导培养基悬浮菌体，在25～35℃下诱导培养48～120h。

BMGY培养基，其配方如下：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB（无氨基酵母氮源），4×10^-5%生物素，1%甘油；

BMMY诱导培养基，其配方如下：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB（无氨基酵母氮源），4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

优选地，步骤（1）中，培养温度为25℃，培养时间为60h；步骤（2）中，培养温度为30℃，诱导时间为96h。

其中，前述发酵方法包括如下步骤：它包括如下步骤：

Ⅰ、制备种子：将重组菌置于YPD培养基中，于25～35℃摇瓶培养24～48h，收集菌液；

Ⅱ、接种：以4～6％的接种量接种到BMGY培养基中，在25～35℃条件下振荡培养；

Ⅲ、补料：待碳源耗尽后，加入浓度为25%（w/v）葡萄糖溶液3.2～3.6L；

Ⅳ、诱导表达：补料结束后，流加甲醇诱导表达，甲醇的浓度维持在0.5%，诱导表达的时间为48～120h。

YPD培养基，其配方如下：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

优选地，步骤Ⅰ中，培养温度为30℃，培养时间为24h；

步骤Ⅱ中，接种量为5%；培养温度为30℃；

步骤Ⅲ中，葡萄糖溶液的加入量为3.4L；

步骤Ⅳ中，诱导表达的时间为120h。

本发明还提供了前述任意一项方法制得的发酵产物。

本发明还提供了前述蛋白的制备方法，它是取前述发酵产物，静置，得上清，分离纯化，即得。

所述分离纯化的方法包括如下步骤：

a、将上清液用浓度为20～90%（w/v）硫酸铵溶液盐析两次，脱盐；