[发明专利]一种重组猪防御素及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

优选地，编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或者SEQ ID NO.3所示。

2.SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

优选地，所述重组载体是重组毕赤酵母表达载体pPIC9。

4.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求4或5所述的重组载体；优选地，所述重组菌为重组毕赤酵母。

5.一种发酵方法，其特征在于：它是将权利要求6或者7所述的重组菌，置于酵母菌培养基中培养，甲醇诱导表达，即得到包含权利要求1所述蛋白的发酵产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）菌体生长：将重组菌接种到BMGY培养基中，于25～35℃培养36～60h，离心收集菌体；

（2）诱导表达：再用BMMY诱导培养基悬浮菌体，在25～35℃下诱导培养48～120h；

优选地，步骤（1）中，培养温度为25℃，培养时间为60h；步骤（2）中，培养温度为30℃，诱导时间为96h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

Ⅰ、制备种子：将重组菌接种至YPD培养基中，于25～35℃摇瓶培养24～48h，收集菌液；

Ⅱ、接种：以4～6％v/v的接种量接种到BMGY培养基中，在25～35℃条件下振荡培养；

Ⅲ、补料：待碳源耗尽后，加入浓度为25%（w/v）葡萄糖溶液3.2～3.6L；

Ⅳ、诱导表达：补料结束后，流加甲醇诱导表达，甲醇的浓度维持在0.5%，诱导表达的时间为48～120h；

优选地，步骤Ⅰ中，培养温度为30℃，培养时间为24h；

步骤Ⅱ中，接种量为5%；培养温度为30℃；

步骤Ⅲ中，葡萄糖溶液的加入量为3.4L；

步骤Ⅳ中，诱导表达的时间为120h。

8.权利要求5～8任意一项方法制得的保护权利要求1所述蛋白的发酵产物。

9.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，其特征在于：它是取权利要求13所述的发酵产物的上清，分离纯化，即可；

优选地，所述分离纯化的方法包括如下步骤：

a、将上清液用浓度为20～90%（w/v）硫酸铵溶液盐析两次，脱盐；

b、加入磷酸缓冲液，采用阴离子交换柱纯化，收集流穿液；

c、调流穿液的pH为5.0～5.4，采用阳离子交换柱纯化，以浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；

d、在洗脱液中加入4～8的%硫酸铵，采用疏水层析纯化，脱盐，干燥，用pH为6.7～7.1的磷酸钠和氯化钠的混合溶液重溶，混合溶液中，磷酸钠的浓度为15～25mmol/L，氯化钠的浓度为0.05～0.15mmol/L；

e、分子筛纯化；

f、高效液相色谱纯化，即可。

进一步优选地，步骤a中，两次盐析采用的硫酸铵浓度依次为70%（w/v）和65%（w/v）；

步骤b中，所述阴离子交换柱为Q-Sepharose阴离子交换柱；

步骤c中，所述pH为5.2，所述阳离子交换柱为S-Sepharose阳离子交换柱，所述氯化钠溶液的浓度为1mol/L；

步骤d中，所述硫酸铵的浓度为6%，疏水层析的介质为Phenyl SepharoseCL-4B；混合溶液的pH为6.9，磷酸钠的浓度为20mmol/L，氯化钠的浓度为0.01mmol/L

步骤e中，所述分子筛为Sephacryl S-100HR分子筛；

步骤f中，高效液相色谱的条件如下：固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A：乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的浓度为10%，三氟乙酸的浓度为0.1%；流动相B：乙腈和三氟乙酸的混合溶液，乙腈的浓度为90%，三氟乙酸的浓度为0.07%；洗脱条件：0-8min,流动相B的用量为15%；8-35min，流动相B用量为40%；35-55min，流动相B的用量为85%;55min后，流动相B的用量为15%；检测波长：220nm。

10.权利要求1所述的蛋白或者权利要求8所述的发酵产物在制备抗菌药物或者抗菌饲料添加剂中的应用。