[发明专利]一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种将膜过滤技术与分子印迹技术相结合的分离提取埃博霉素B的方法，具体涉及一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法。

背景技术

埃博霉素B(Epothilone B)是微生物纤维堆囊菌产生的一类大环内酯类次级代谢产物，分子式为C₂₇H₄₁NO₆S，相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，是目前抗肿瘤药物的一个研究热点。

研究发现埃博霉素B不仅具有与紫杉醇相同的作用机制，可以促进GTP(三磷酸鸟苷)依赖性微管蛋白聚合形成微管，并且对微管有稳定作用。而且具有比紫杉醇更优越的特性，结构简单，良好的水溶性和极大的药用潜力，使得人们投入了巨大的热情进行研究，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。研究者把很多的精力投入到对其合成及分离提取上，但是，对于埃博霉素的分离提纯，目前所采用的方法都具有以下缺陷和不足：步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用很高，产物得率较低，成本较高，尤其是难以实现工业化的大规模生产。因而，研究能够有效地分离纯化埃博霉素的新方法，以降低埃博霉素的成本，具有十分重要的意义。

随着生化分离技术的进步，各种先进的设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜技术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜过滤技术根据其孔径大小，能阻拦溶液中的各种不同分子量的溶质与通常的方法相比，具有不经过相的转换、不需要添加化学试剂、滤膜不易堵塞和耐用等优点，以达到浓缩或分离的目的。

分子印迹技术是近十几年来分离领域中发展起来的一门新兴技术。分子印迹聚合物对目标分子具有预定选择性、特异性地识别，可将目标分子从混合溶液中分离出来。并且具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点，使得在药物分离方法已有成功应用的实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其操作简便，分离步骤少，选择性高，分离效率较以往技术大幅提升，极大地降低了提纯成本，并且适合于大规模的工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120～150h后过滤得到吸附树脂；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；

（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提吸附树脂，收集浸提液；

（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000～5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质；并用乙酸乙酯洗滤，合并滤液，得粗提物；

（4）添加分子印迹聚合物：向粗提物中加入埃博霉素B分子印迹聚合物来特异性吸附埃博霉素B，在摇床上震荡后离心并收集下层沉淀物，再用甲醇对沉淀物进行多次洗脱，收集洗脱液；其中，埃博霉素B分子印迹聚合物的加入量为粗提物体积的5～10%；

（5）结晶：将洗脱液进行真空浓缩，得浅黄色浓缩液；将浓缩液于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569；液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；大孔树脂的型号为XAD-16大孔树脂。

所述步骤（1）中大孔树脂采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12-16h后，取出倒掉甲醇，再用纯水洗至无甲醇味；然后再用甲醇浸泡12-16h后，除去甲醇并用纯水洗至无甲醇味。

所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。

所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。

所述步骤（3）中超滤膜过滤的压力为0.1-0.6MPa，温度0-40℃，流速为5-10mL/min。