[发明专利]一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法

权利要求书

1.一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120～150h后过滤得到吸附树脂；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；

（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提吸附树脂，收集浸提液；

（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000～5000的超滤膜过滤以去除大分子杂质，得粗提物；

（4）添加分子印迹聚合物：向粗提物中加入埃博霉素B分子印迹聚合物来特异性吸附埃博霉素B，在摇床上震荡后离心并收集下层沉淀物，再用甲醇对沉淀物进行多次洗脱，收集洗脱液；其中，埃博霉素B分子印迹聚合物的加入量为粗提物体积的5～10%；

（5）结晶：将洗脱液进行真空浓缩，得浅黄色浓缩液；将浓缩液于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569；液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2；大孔树脂的型号为XAD-16大孔树脂。

3.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中大孔树脂采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12-16h后，取出倒掉甲醇，再用纯水洗至无甲醇味；然后再用甲醇浸泡12-16h后，除去甲醇并用纯水洗至无甲醇味。

4.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。

5.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。

6.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中超滤膜过滤的压力为0.1-0.6MPa，温度0-40℃，流速为5-10mL/min。

7.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中埃博霉素B分子印迹聚合物的粒径为40-60um；步骤（4）中摇床的转速为100～160r/min，震荡时间为24-48h；步骤（4）中离心是在室温下以2500～3000r/min的转速离心20～30min。

8.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（4）中埃博霉素B分子印迹聚合物是由以下方法制得的：将埃博霉素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩尔比1:4:20混合均匀后，再溶解于体积比为4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，搅拌均匀后加入偶氮二异丁氰；充N₂反应12-14h后研磨得颗粒状固体，最后用甲醇洗脱埃博霉素B；其中，偶氮二异丁腈与埃博霉素B的比为5mg：1mol。

9.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，脱去埃博霉素B的分子印迹聚合物经过甲醇洗涤，然后真空干燥后还能够作为埃博霉素B的特异性吸附剂在分离提取时加入，重复使用次数为2～5次。

10.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹吸附技术的埃博霉素B分离提取方法，其特征在于，所述步骤（5）中浓缩的温度40～45℃，真空度-0.085～-0.09MPa。