[发明专利]一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法。

背景技术

胶原是一种广泛存在于动物的结构蛋白质，是由动物细胞合成的一种生物性高分子。广泛存在于动物骨、脚、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。多数类型的胶原蛋白分子都由3条螺旋肽链相互盘绕而成，3链相互缠绕，形成了胶原蛋白分子特有的杆状结构。胶原蛋白是一类重要的资源，目前，己广泛地应用于医药工业、食品工业、日用化学品工业等方面都有重要的作用。

在饲料工业中：胶原蛋白作为一种高效的动物性蛋白营养添加剂。

在生物医学材料方面的应用：制作心脏瓣膜；血管修复的替换血管装置；作为烧伤伤口的敷料（使血液凝固，具有止血功能）；制造人造皮肤。

在食品方面：胶原蛋白材料制备薄膜材料；制造肠衣等可食用包装材料；作为肉制品添加剂、保健食品等。

另外，胶原蛋白具有优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效,一些知名品牌公司已推出了纯胶原蛋白和一系列添加了纯胶原蛋白的护肤品。

胶原蛋白得到了广泛的应用，大量的需求突出了提取胶原蛋白迫切性，用胶原蛋白酶进行生产就是其中重要的一种方法。

胶原蛋白酶是指作用于胶原或其变性明胶而不作用其它蛋白质的酶类，它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原酶。胶原酶在环境保护上可用于皮革边角废弃物变废为宝，高值转化；在医学研究中可用于治疗腰椎间盘突出症、瘢痕疙瘩、杜普伊特伦症等，具有极大的应用价值。来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等的胶原蛋白酶已有广泛的研究。目前，已从许多动物组织和微生物中获得胶原蛋白酶。但对于来自于海洋微生物中的胶原蛋白酶的研究甚少，而海洋由于其多变复杂的环境，多样的生命形式，使得海洋中蕴藏着种类多样，功能各异且具有强烈活性的生物蛋白酶。本研究试从实验室保存的海洋微生物中筛选胶原蛋白酶产生菌，并将其胶原蛋白酶基因导入工程菌中进行异源表达，对海洋来源胶原蛋白酶进行一个初探式研究。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法。

一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，是以交替假单胞菌MB004基因组DNA为模板，该交替假单胞菌MB004的核苷酸序列如<400>1所述，用PCR方法克隆MB004的编码基因，将该基因重组到表达质粒pET28a中，获得重组质粒pET28a-Pnjc，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到大肠杆菌Rosseta感受态细胞中，获得整合了质粒的重组表达菌株Rosseta(DE3)/pET28a-Pnjc，接种到LB培养基中培养诱导表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩，经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。

进一步地，所述PCR方法中所用引物为：

引物P1：5’-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3’；

引物P2：5’-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3’；

并在引物p1和引物p2的5’端分别引入酶切位点BglⅡ和XhoⅠ位点。

进一步地，所述PCR方法中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃延伸10min。

进一步地，所述交替假单胞菌MB004基因组DNA的克隆采用16S rRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，目的片段经回收纯化后与pMD18-T Vector连接，然后转化到DH5α细胞，提取重组质粒进行目的片段的测序。

进一步地，所述引物27F为：5’-AGAGTTTGATCCTGGC-3’。

进一步地，所述引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。