[发明专利]一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法

权利要求书

1.一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，是以交替假单胞菌MB004基因组DNA为模板，该交替假单胞菌MB004的核苷酸序列如<400>1所述，用PCR方法克隆MB004的编码基因，将该基因重组到表达质粒pET28a中，获得重组质粒pET28a-Pnjc，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到大肠杆菌Rosseta感受态细胞中，获得整合了质粒的重组表达菌株Rosseta(DE3)/pET28a-Pnjc，接种到LB培养基中培养诱导表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩，经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。

2.根据权利要求1所述的利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，其特征在于所述PCR方法中所用引物为：

引物P1：5’-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3’；

引物P1：5’-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3’；

并在引物p1和引物p2的5’端分别引入酶切位点BglⅡ和XhoⅠ位点。

3.根据权利要求1或2所述的利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，其特征在于所述PCR方法中的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，其特征在于所述交替假单胞菌MB004基因组DNA的克隆采用16SrRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，目的片段经回收纯化后与pMD18-T Vector连接，然后转化到DH5α细胞，提取重组质粒进行目的片段的测序。

5.根据权利要求4所述的利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，其特征在于所述引物27F为：5’-AGAGTTTGATCCTGGC-3’。

6.根据权利要求4所述的利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，其特征在于所述引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。