[发明专利]聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种利用聚乙二醇固定桔小实蝇气味结合蛋白的方法，以及利用桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测水果挥发性气味物质（β-紫罗兰酮及乙酸异戊酯）的方法。 

背景技术

桔小实蝇是一种对多种果蔬具有很大威胁的害虫，它的寄主范围极广，涉及到250多种果蔬。所以对于桔小实蝇的防治是农业、林业检疫部门一项重要任务。针对桔小实蝇对水果气味灵敏的感知特性，可以建立特殊水果气味的传感器用于桔小实蝇的防治。气味结合蛋白是一种存在于桔小实蝇触角嗅觉细胞外的低分子量疏水性蛋白。它能够与目标气味分子可逆地结合，起到运输疏水性小分子的作用。桔小实蝇气味结合蛋白容易获取、结构稳定，可以作为生物敏感元件构建生物传感器。利用桔小实蝇气味结合蛋白和阻抗传感器结合的优势，发展一种基于电化学阻抗分析的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器，可以特异性的检测水果挥发性气味物质（β-紫罗兰酮及乙酸异戊酯），可以用于食品成分快速检测、昆虫养殖及桔小实蝇等昆虫防治等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白电化学阻抗传感器的制备及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：其特征在于，包括以下步骤：

（1）加工圆线型叉指金电极阻抗传感器：以玻璃为基底，在玻璃基底上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出圆线型叉指图形，再采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到圆线型叉指金电极以及外接引脚，最后将芯片腔用环氧树脂胶封在玻璃基底上，制得圆线型叉指金电极阻抗传感器；

（2）固定桔小实蝇气味结合蛋白，该步骤通过以下子步骤来实现：

（2.1）首先，将圆线型叉指金电极在由质量浓度为98%以上的浓硫酸和体积浓度为30%的双氧水溶液按体积比为7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超纯水冲洗3次以上，最后依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的圆线型叉指金电极，用氮气吹干；

（2.2）配制浓度为1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶剂由无水乙醇和超纯水按体积比3:7混合组成；将聚乙二醇溶液滴加在圆线型叉指金电极上至完全覆盖圆线型叉指金电极，在室温下静置24h，聚乙二醇中的巯基与圆线型叉指金电极反应生成金硫键，进而将聚乙二醇固定于圆线型叉指金电极上，之后再吸出芯片腔的残留的聚乙二醇溶液；

（2.3）分别加入体积均为聚乙二醇溶液一半的浓度为8mg/ml 的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液和浓度为12mg/ml的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1M MES缓冲液，15min后，再加入NaHCO₃溶液调节pH至7.2-7.4；

（2.4）然后加入与聚乙二醇溶液等体积的浓度为67 μg/ml 的桔小实蝇气味结合蛋白溶液，桔小实蝇气味结合蛋白溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静止2h，使得桔小实蝇气味结合蛋白与聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出芯片腔中残留的液体，再向芯片腔中加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的桔小实蝇气味结合蛋白，重复3次后即可获得聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，置于4℃条件下备用。

应用上述聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测水果挥发性气味物质的方法，包括以下步骤：

（1）配制待测水果挥发性气味物质标准样品溶液：采用物质的量浓度为0.01M待测的水果挥发性气味物质的标准贮备溶液稀释配制5种相应浓度梯度的标准样品溶液；稀释液为0.1M PBS缓冲液；