[发明专利]聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法

权利要求书

1.一种聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）加工圆线型叉指金电极阻抗传感器：以玻璃为基底，在玻璃基底（1）上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出圆线型叉指图形，再采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到圆线型叉指金电极（2）以及外接引脚（3），最后将芯片腔（7）用环氧树脂胶封在玻璃基底（1）上，制得圆线型叉指金电极阻抗传感器；

（2）固定桔小实蝇气味结合蛋白，该步骤通过以下子步骤来实现：

（2.1）首先，将圆线型叉指金电极（2）在由质量浓度为98%以上的浓硫酸和体积浓度为30%的双氧水溶液按体积比为7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超纯水冲洗3次以上，最后依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的圆线型叉指金电极（2），用氮气吹干；

（2.2）配制浓度为1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶剂由无水乙醇和超纯水按体积比3:7混合组成；将聚乙二醇溶液滴加在圆线型叉指金电极（2）上至完全覆盖圆线型叉指金电极（2），在室温下静置24h，聚乙二醇中的巯基与圆线型叉指金电极（2）反应生成金硫键，进而将聚乙二醇固定于圆线型叉指金电极（2）上，之后再吸出芯片腔（7）的残留的聚乙二醇溶液；

（2.3）分别加入体积均为聚乙二醇溶液一半的浓度为8mg/ml 的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液和浓度为12mg/ml的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1M MES缓冲液，15min后，再加入NaHCO₃溶液调节pH至7.2-7.4；

（2.4）然后加入与聚乙二醇溶液等体积的浓度为67 μg/ml 的桔小实蝇气味结合蛋白溶液，桔小实蝇气味结合蛋白溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静止2h，使得桔小实蝇气味结合蛋白与聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出芯片腔（7）中残留的液体，再向芯片腔（7）中加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的桔小实蝇气味结合蛋白，重复3次后即可获得聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，置于4℃条件下备用。

2.一种聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器检测水果挥发性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制待测水果挥发性气味物质标准样品溶液：采用物质的量浓度为0.01M待测的水果挥发性气味物质的标准贮备溶液稀释配制5种相应浓度梯度的标准样品溶液，稀释液为0.1M PBS缓冲液； 

（2）检测水果挥发性气味物质标准样品溶液，建立水果挥发性气味物质标准浓度-归一化阻抗曲线：空白对照溶液电化学阻抗图谱的测量：先将圆线型叉指金电极（2）的两个外接引脚（3）分别通过导线（8）连接电化学工作站（9）的两个输入端，然后向芯片腔（7）内加入与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有10mM铁氰化钾、10mM亚铁氰化钾和0.1M的KCl，溶剂为超纯水，再向芯片腔（7）中加入与氧化还原对溶液等体积的PBS缓冲液，以电化学工作站（9）作为仪器平台对的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔（7）中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极（2），再进行水果挥发性气味物质标准样品溶液电化学阻抗图谱的测量，向芯片腔（7）中加入等量的与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液和某一物质的量浓度的水果挥发性气味物质溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的水果挥发性气味物质标准样品溶液对应的电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔（7）中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置15min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极（2）；

（3）建立水果挥发性气味物质溶液标准浓度-归一化阻抗曲线：重复上述步骤2中空白对照溶液和水果挥发性气味物质标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5种相应浓度梯度的水果挥发性气味物质标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的电化学阻抗谱图和电子传递电阻，计算归一化阻抗（标准样品溶液与空白对照溶液差值相对于空白对照溶液的变化值），得到水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度与归一化阻抗之间的关系曲线y=a^-bx，其中，x为水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度，y为归一化阻抗，a和b为常数，实现对水果挥发性气味物质的检测。