[发明专利]一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导剂、诱导培养基及方法。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种以糖脂代谢紊乱为主要特征的内分泌代谢性疾病。根据世界卫生组织和国际糖尿病联盟公布的预测，到2030年，全球糖尿病患者将达3.7亿。目前我国DM患者已超过4500万，仅次于印度居第二位。尽管其病因不同，但都表现为胰岛细胞数量及功能的缺陷，最终都需要使用胰岛素进行治疗。尽管由于胰岛素的应用，尤其是近年来在胰岛素剂型以及给药途径等方面均取得了一些进展，但实践证明外源性胰岛素并不能像人体自身分泌胰岛素那样完美地控制血糖并恒定维持血糖正常。细胞替代疗法是治疗糖尿病的重要方法，是一种更接近生理方式的有效方法，可实现对血糖进行持续监测和精细调节。近些年，经肝门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病也获得了一些疗效，但胰岛细胞移植面临着两个难题：供体来源不足及严重的免疫排斥反应。 

干细胞作为一种具有自我更新及多向分化的细胞，在一定条件下可分化为具有功能性的胰岛细胞，因此可作为胰岛细胞的全新来源。目前由干细胞分化获得胰岛细胞有三种途径：1、胚胎干细胞分化；2、胰岛干细胞或胰岛前体细胞分化；3、成体干细胞分化。由于胚胎干细胞具有伦理争议，且很难获得胰岛干细胞，而成体干细胞来源广泛，无伦理争议，可作为胰岛细胞的来源。

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞后干细胞领域另一个备受关注的热点。

目前的干细胞诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，诱导分化效率低，胰岛分泌能力仅为正常胰岛1%左右，且诱导过程复杂，诱导时间长，所得细胞数量少，功能低。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂。该诱导剂成分安全无毒，诱导成功率高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的诱导剂，由以下组分组成：大株红景天注射液、烟酰胺、牛磺酸和GLP-1。

所述诱导剂各组分的质量浓度配比为：大株红景天注射液20～40 g/L、烟酰胺0.97～1.47g/L、牛磺酸0.25～0.50 g/L，GLP-1 26.84～40.27mg/L。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述诱导剂的诱导培养基，所述诱导培养基通过以下方法制备而成：每1000ml所述诱导培养基中含有大株红景天注射液20～40 g、烟酰胺0.97～1.47g、牛磺酸0.25～0.50 g、GLP-1 26.84～40.27mg，余量为人间充质干细胞无血清培养基，混匀过滤除菌即可。

本发明的另一个目的是提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，该方法包括以下步骤：

1、脂肪间充质干细胞的制备：将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养、传代培养；

2、脂肪间充质干细胞的鉴定：取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记；

3、诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛细胞：传3代的脂肪间充质干细胞，0.125%～0.01％Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×10⁴/cm²，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞达接近80%融合，生长旺盛时用诱导剂进行诱导分化；

4、诱导后胰岛细胞鉴定：（1）双硫腙染色反应；（2）化学发光免疫分析法检测胰岛素水平；（3）ELISA试剂盒检测诱导获得的胰岛样细胞是否具有胰岛素分泌功能；（4）葡萄糖刺激实验；（5）动物模型体内移植实验。