[发明专利]一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。 

背景技术

排泄分泌抗原(ES抗原)是在寄生虫的感染过程中，由其口器和排泄孔分泌或排泄的抗原物质。线虫的ES系统有许多功能，包括渗透调节、离子调节及排泄、分泌等。分泌的物质在体外可以降解细胞基质，破坏宿主组织，引起临床的过敏反应，如麻疹和水肿。运用分子克隆技术获得纯化的重组寄生虫抗原，其有效性和特征性已经在许多寄生虫感染的诊断中得到了印证。这些合成的蛋白包括了寄生生活及感染过程中的分泌排泄抗原―ES抗原。 

相关研究表明，简单异尖线虫三期幼虫可以侵入宿主的胃肠黏膜释放ES蛋白。Anis4是简单异尖线虫的一个抗原基因，相关研究结果显示，体外表达的该蛋白具有ES蛋白性质，其具有高度的耐热性，表达的抗原中不包含糖基化作用。该抗原蛋白经过长时间的加热，仍然能够识别在人体病原感染病例中的阳性血清样本，所以研究认为该蛋白与临床检测相关。在应用该抗原检测人体感染病例研究中，显示Ani s4表达抗原能与大部分病人血清产生特异反应。天然的ES蛋白获得具有非常大的难度，且国内尚无Ani s4基因体外表达的相关方法报道。鉴于Ani s4基因的抗原特性以及表达ES蛋白良好的免疫原性和保护效果，本发明研究对其进行克隆和表达，作为深入研究简单异尖线虫相关检测的工具。 

发明内容

本发明提供一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法，包括如下步骤： 

①简单异尖线虫总RNA的提取， 

②简单异尖线虫Ani s4抗原基因的RT-PCR扩增， 

根据Ani s4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamH I和Hind Ш酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下： 

上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3'（SEQ ID NO.1）， 

下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA—3'（SEQ ID NO.2）， 

以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s4， 

③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani-s4； 

④原核表达载体的构建和鉴定： 

BamH I和HindШ双酶切质粒pMD18-T-Ani-s4和质粒pET-32a，回收所需目的片段，加入T4DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌，BamH I和HindШ双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani-s4； 

⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白， 

含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L后34℃继续振荡培养进行诱导表达； 

诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达。 

作为优选，IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的具体步骤如下： 

含重组表达质粒的菌种活化后，取1ml阳性菌接种到50mL含Amp的LB液体培养基中，于37℃摇床中以195rpm振摇培养，至菌液的OD值约为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L后34℃继续振荡培养，分别在诱导前(0h)和诱导后2、4、6、8h吸取2mL菌样于4℃，5000rpm离心5min，收集细菌沉淀，用PBS重悬洗涤2次，加入40μl的1×SDS上样缓冲液，煮沸7min，冰浴2min，12000rpm离心5分钟，同时设立带pET-32a质粒的BL21大肠杆菌对照； 

同时，将剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加1mL裂解缓冲液、10μl溶菌酶，将40ml菌液浓缩至4ml，超声波裂解浓缩菌液后12000rpm离心1min，沉淀用PBS重悬加入40μl的1×SDS上样缓冲液，上清加入等量的2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，冰浴2min，-20℃备用。 

作为优选，超声波裂解浓缩菌液的条件为200w，处理4s，间隔4s，共99次。