[发明专利]一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法

权利要求书

1.一种简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于包括如下步骤：

①简单异尖线虫总RNA的提取，

②简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的RT-PCR扩增，

根据Ani s 4抗原基因其阅读框的序列特点，在序列的两端分别加上BamHI和Hind Ш酶切位点设计引物，同时增加保护性碱基；设计的引物如下：

上游引物5'—CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3' （SEQ ID NO.1），

下游引物5'—CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3' （SEQ ID NO.2），

以步骤①提取的总RNA为模板，反转录出单链cDNA，经PCR扩增，获得目的基因Ani s 4，

③将纯化后的目的基因PCR产物和pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T-Ani-s4；

④原核表达载体的构建和鉴定：

BamHI和Hind Ш双酶切质粒pMD18-T-Ani-s4和质粒pET-32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA连接酶进行连接；将连接产物转化感受态细胞，抽提质粒；再应用质粒转化大肠杆菌， BamH I和Hind Ш双酶切筛选阳性克隆，命名为pET32a-Ani-s4；

⑤IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，

含重组表达质粒的菌种活化后，将阳性菌接种到含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液的OD值为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L后34 ℃继续振荡培养进行诱导表达； 

诱导表达后通过SDS-PAGE分析，发现有特异性条带出现，即完成简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达。

2.根据权利要求1所述的简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白的具体步骤如下：  

含重组表达质粒的菌种活化后，取1ml阳性菌接种到50mL含Amp的LB液体培养基中，于37 ℃摇床中以195rpm振摇培养，至菌液的OD值约为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L后34 ℃继续振荡培养，分别在诱导前(0h)和诱导后2、4、6、8 h吸取2mL菌样于4℃，5000 rpm离心5 min，收集细菌沉淀，用PBS重悬洗涤2次，加入40μl的1×SDS上样缓冲液，煮沸7 min，冰浴2 min，12000rpm离心5分钟，同时设立带pET-32a质粒的BL21大肠杆菌对照；

同时，将剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加1 mL裂解缓冲液、10 μl溶菌酶，将40ml菌液浓缩至4ml，超声波裂解浓缩菌液后12000 rpm离心1 min，沉淀用PBS重悬加入40μl的1×SDS上样缓冲液，上清加入等量的2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，冰浴2 min，-20℃备用。

3.根据权利要求2所述的简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于：超声波裂解浓缩菌液的条件为200 w，处理4 s，间隔4 s，共99次。

4.根据权利要求1或2或3所述的简单异尖线虫Ani s 4抗原基因的克隆和表达方法，其特征在于：RT-PCR扩增的反应体系为：10×PCR buffer 5μl，10mM dNTPs 4μl，ANCE-Up 1μl，ANCE-Down 1μl，cDNA 2μl，ddH2O       36.5μl，5 U/μl Taq酶  0.5μl，总体积  50.0μl；扩增程序：94℃ 5min→94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃1min，30个循环→72℃ 10min。